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这篇研究论文介绍了一种名为NEST的新型微流控装置，该装置利用高深宽比纳米矛在连续流中实现对细胞膜和核膜(NE)的高通量、可控机械穿孔。该技术无需化学或病毒载体(如PEI)，即可将质粒DNA(pDNA)等大分子直接递送至细胞核，实现快速基因表达(4小时即可检测到EGFP蛋白)，其通量和表达速度可与显微注射媲美，但细胞存活率更高(77%)。这为CAR-T细胞疗法和基因治疗等领域提供了一种高效、无载体的细胞工程新工具。
细胞转染，即向细胞内导入遗传物质以改变其功能的过程，在医学领域有着广泛的应用。传统的化学和病毒载体递送方法存在细胞毒性、成本高、免疫原性或递送效率有限等问题。机械方法通过物理方式在细胞上产生开口以递送货物，成为了一种有前景的替代方案。然而，许多系统产生的细胞膜开口太小，无法递送大分子货物，或者打孔过程会导致细胞活力低下。本研究报道了一种创新的纳米工程表面技术(NEST)设备，它集成了高深宽比的纳米矛结构，能够在高通量条件下可重复地穿孔细胞膜和核膜，实现直接的细胞核递送。
设计与表征
NEST设备在微流控通道底部集成了尖锐的纳米矛结构(高2 μm，长4 μm，尖端约100 nm宽，角度约40°)。当细胞悬浮液在压力驱动下流经这些通道时，每个细胞会与一个纳米矛接触并被其穿刺。这种设计能精确地在细胞膜和核膜上产生足够大的孔洞，以允许大分子货物进入，同时确保细胞在治疗后能够恢复。为优化每个细胞类型的递送效率和存活率，需针对不同细胞的大小调整微通道尺寸。共聚焦显微镜成像证实，处理后细胞膜和核膜上均出现了直径约为7.4 μm和2.6 μm的孔洞，这为货物直接进入细胞核提供了可视化的证据。
细胞活力与递送效率的优化
流体压力是影响NEST设备打孔效果和细胞活力的关键参数。在HeLa细胞中，压力优化为28 psi时，可在保持77%高存活率的同时，实现79%的3 kDa和70%的70 kDa葡聚糖递送效率。在这种优化条件下，该设备能以极高的通量运行，理论上每分钟可处理高达数千万个细胞。虽然高细胞密度可能导致通道堵塞，但可通过分批处理和反向冲洗来维持高通量运作。
细胞核递送的验证
使用70 kDa的荧光标记葡聚糖(其流体力学半径超过细胞核的被动渗透极限)进行递送实验。共聚焦显微镜图像显示，葡聚糖成功进入细胞质和核质，这直接证明了NEST设备不仅能穿孔细胞膜，还能穿透核膜，并允许大分子货物通过扩散进入细胞核。这一能力是实现无需载体的核酸直接核递送的基础。
多样化的胞内货物递送
NEST设备在多种细胞类型中都展现出高效的胞内递送能力。对于3 kDa的小葡聚糖，在CT26、HeLa、A20、Jurkat以及原代人类T细胞中，递送效率均超过60%，在CT26细胞中甚至高达91%。特别值得注意的是，该设备对不同分子量(3 kDa、70 kDa、2000 kDa)葡聚糖的递送效率差异不大，表明其递送机制对货物大小的依赖程度远低于典型的基于扩散的方法。这主要归因于NEST设备产生的孔洞远大于大分子货物的尺寸，使得中、大型货物的递送效率相近。
质粒DNA的快速蛋白表达
在基因转染中，成功将质粒DNA递送至细胞质并不保证蛋白表达，因为DNA需进入核内才能被转录。本研究证明，NEST设备能够通过直接核膜穿孔，以超过60%的效率实现裸露质粒DNA的转染。相比之下，化学载体聚乙烯亚胺(PEI)的转染效率为48%，而没有纳米矛的对照NEST设备则几乎无法实现转染。动态表达分析显示，NEST处理后仅1小时就能检测到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)信号，4小时内近50%的细胞已开始表达，而PEI转染在12小时后才出现显著的EGFP信号，脂质体转染(Lipofectamine)和电穿孔(EP)也显示出类似的延迟表达模式。NEST的表达动力学与显微注射类似，表明其无需等待细胞分裂，而是通过机械穿孔直接实现了DNA的核内递送，从而极大缩短了蛋白质表达的时间。
治疗后的细胞完整性
为了评估NEST处理对细胞的长期影响，研究检测了细胞增殖和DNA损伤。结果表明，无论是否递送质粒DNA，NEST处理后的HeLa细胞在7天内均保持了正常的指数生长速率。在DNA损伤方面，采用商业化试剂盒检测DNA双链断裂后的组蛋白募集，结果显示NEST处理组与未经处理的对照组之间无统计学显著差异，损伤细胞比例均低于5%。此外，膜修复实验证实，约50%的细胞在治疗后1分钟内恢复，90%在10分钟内恢复。这些数据共同表明NEST处理在实现高效递送的同时，能较好地维持细胞的生理功能和基因组稳定性。
讨论与意义
核膜孔道化是实现外源质粒DNA快速表达的关键策略。NEST技术通过机械方式精确控制核膜穿孔，解决了化学转染依赖细胞周期、非核靶向方法表达慢的瓶颈。与同样能实现核递送的基于电穿孔的DFE设备相比，NEST设备虽在某些递送效率上略低，但其非电穿孔机制对某些对电刺激敏感的细胞(如原代免疫细胞)更具优势，且能产生更大的孔洞，更适用于递送微米级颗粒、大型蛋白质复合体或DNA折纸结构等大尺寸货物。其独特的高通量、无载体递送特性，使其在快速生产基因工程细胞方面展现出巨大潜力，尤其是在需要高效递送的CAR-T细胞疗法或诱导多能干细胞重编程等治疗应用领域。
综上所述，NEST设备通过机械穿孔同时破坏细胞膜和核膜，实现了高通量、高效率的无载体基因递送，并以接近显微注射的速度启动了蛋白质表达，同时保持了较高的细胞活力和正常的细胞生理功能。这项技术为治疗疑难杂症的工程化活细胞的制造提供了新的工具和视角。
