《Journal of Agriculture and Food Research》：The effect of short-term gaseous ozone treatment on physical attributes and senescence-related enzymes of ‘Eureka’ lemons during cold sterilization
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为解决合成杀菌剂在鲜果上使用的限制，研究人员探讨了臭氧（O3）作为一种无残留技术，在‘尤力卡’柠檬（Eureka lemons）冷杀菌期间对果实物理品质及氧化应激相关酶（如CAT、POD、LOX、GR）的影响。研究发现，虽然臭氧处理能增强部分抗氧化酶活性，但也加剧了果实腐烂和衰老标志，提示其在柠檬冷杀菌中的应用需谨慎优化。
在全球范围内，柑橘类水果，尤其是柠檬，凭借其丰富的生物活性成分，广泛应用于食品、医药、化妆品等多个行业。然而，为了满足国际市场严格的植物检疫要求，柠檬等水果在出口前通常需要经历一场“冰与火的考验”——冷杀菌处理。这项强制性的处理要求水果在接近冰点的低温（如0°C）下储存长达数周，以杀灭潜在的病虫害。不幸的是，这种看似温和的处理实则颇具“侵略性”，常常导致果实品质下降，出现冷害、表皮崩溃和腐烂等采后问题。与此同时，随着人们对食品安全和环境健康的日益关注，传统化学合成杀菌剂的使用正受到越来越多的限制。因此，寻找安全、有效、无残留的替代保鲜技术，成为采后科学领域的一大挑战。
在此背景下，臭氧（O3）作为一种强氧化剂和广谱杀菌剂，因其强大的消毒能力和使用后可自行分解、不产生有害残留的特性，近年来备受关注。先前的研究表明，臭氧处理对多种果蔬具有延长货架期、保持品质的潜力。然而，对于柠檬这种重要的柑橘类水果，尤其是在严苛的冷杀菌处理条件下，气态臭氧处理究竟会如何影响其关键的物理品质（如色泽、硬度）以及果实内部对抗衰老和氧化应激的“防御系统”——即一系列与衰老相关的酶活性，科学界仍知之甚少。为了解答这些问题，南非夸祖鲁-纳塔尔大学（University of KwaZulu-Natal）的Hlumelo Mhlwatika、Nonjabulo L. Bambalele、Olaoluwa O. Olarewaju、Samson Z. Tesfay、Lembe S. Magwaza和Asanda Mditshwa等研究人员，在《Journal of Agriculture and Food Research》上发表了一项研究，系统探究了短时气态臭氧处理对‘尤力克’（Eureka）柠檬在冷杀菌期间的物理属性及衰老相关酶的影响。
研究人员采用了几项关键技术方法来开展这项研究。首先，他们从南非夸祖鲁-纳塔尔省的Carisbrooke Citrus Valley Farm采购了‘尤力克’柠檬作为实验材料。核心处理是在实验室条件下，使用电晕放电臭氧发生器，对柠檬果实进行浓度恒定为0.3 mg/L的气态臭氧暴露，并设置了两个暴露时间梯度：24小时和48小时，以未经处理的柠檬作为对照。处理后的果实按照出口市场的标准冷杀菌协议，在0°C和95%相对湿度的条件下储存28天，随后转移至16°C的常温环境下再储存7天，以模拟货架期。在整个35天的储存期内，研究人员定期（第0、14、28、35天）取样，系统评估了果实的腐烂率、失重率、色泽（通过色度计测量L, a, b*值并计算柑橘色泽指数CCI）、硬度（使用硬度计测量）等物理品质指标。在生化层面，他们重点测定了与氧化应激和衰老密切相关的四种关键酶的活性：过氧化氢酶（Catalase, CAT）、过氧化物酶（Peroxidase, POD）、脂氧合酶（Lipoxygenase, LOX）和谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase, GR），同时也评估了反映膜脂损伤程度的脂质过氧化水平。所有数据均进行了统计学分析以评估处理的显著性影响。
3.1. 腐烂率
研究结果显示，臭氧处理显著增加了柠檬果实的腐烂率。在评估期末（第35天），未经处理的对照组腐烂率仅为0.91%，而臭氧处理24小时和48小时的果实，腐烂率分别升高至3.2%和4%。更重要的是，臭氧处理的果实（第28天）比对照组（第35天）更早开始出现腐烂迹象。这表明，在当前实验设置下，气态臭氧处理非但没有保护柠檬，反而可能加剧了其在冷杀菌期间的腐烂进程，且暴露时间越长，腐烂越严重。
3.2. 果实失重
储存时间显著影响果实失重，所有处理组的失重都随着储存期延长而增加。然而，臭氧处理本身以及处理与储存时间的交互作用对失重没有产生统计学上的显著影响。在评估期末，对照组、臭氧48小时和24小时处理的失重率分别为16%、10%和9%。
3.3. 色泽
储存时间显著影响了果实的色泽变化，但臭氧处理本身及其与储存的交互作用对果实颜色（以CCI衡量）的影响不显著。对照组果实的色泽指数在整个储存期内波动较大，而臭氧处理组的色泽变化相对更平缓一些。
3.4. 硬度
臭氧处理显著影响了果实的硬度。在所有处理中，果实硬度在储存期间均呈下降趋势。值得注意的是，臭氧处理48小时的果实硬度损失率最低（1.79%），低于对照组（2.58%）和臭氧处理24小时组（2.60%）。这说明，虽然臭氧加剧了腐烂，但在一定程度上帮助维持了果实的硬度，这可能与臭氧抑制了细胞壁降解酶的活性有关。
3.5. 过氧化氢酶
臭氧处理显著增强了过氧化氢酶的活性。从第0天到第35天，臭氧处理24小时的果实CAT活性增加了47%，增幅最大。臭氧处理48小时的果实在前28天CAT活性也呈上升趋势，但在随后的常温储存期出现下降。CAT活性的升高被认为是果实对臭氧诱导的氧化应激的一种防御反应，旨在清除过氧化氢（H2O2）。
3.6. 过氧化物酶
处理和储存时间均单独显著影响了过氧化物酶的活性。所有处理组的POD活性在储存期间均持续上升，且臭氧暴露时间越长，POD活性越高。POD活性升高通常与酶促褐变、细胞损伤和品质劣变有关，因此臭氧处理下POD的升高可能是果实对臭氧和低温引起的细胞损伤和表皮崩溃的一种响应。
3.7. 脂氧合酶
处理类型和储存时间对脂氧合酶的浓度有显著影响。对照组和臭氧处理24小时的LOX活性呈相似的上升趋势。在大部分储存期内，臭氧处理48小时的LOX活性高于24小时处理组。LOX是膜脂过氧化和衰老的标志，其活性升高会破坏细胞膜完整性。臭氧处理导致的LOX升高，表明臭氧可能诱导了氧化应激，激活了LOX，从而损害了果皮完整性。
3.8. 谷胱甘肽还原酶
臭氧处理显著提高了谷胱甘肽还原酶的活性。在整个储存期间，所有处理组的GR活性均呈上升趋势。除了在货架期，两个臭氧处理组的GR活性始终高于对照组，其中臭氧处理48小时的GR浓度最高。GR是一种重要的抗氧化酶，其活性升高是果实应对氧化应激、产生抗氧化防御机制的体现。
3.9. 脂质过氧化
在本研究中，所有处理和储存时间内，反映膜脂损伤程度的脂质过氧化水平均未受到显著影响。
结论与讨论
这项研究得出了一个颇具警示意义的结论：在模拟出口冷杀菌的严苛条件下（0°C， 28天），使用0.3 mg/L的气态臭氧处理‘尤力克’柠檬24或48小时，虽然能轻微改善果实硬度和显著增强过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶等抗氧化酶的活性，但整体上弊大于利。最突出的负面影响是显著提高了果实的腐烂率，且臭氧处理时间越长，腐烂越严重。同时，作为衰老关键标志物的过氧化物酶和脂氧合酶的活性也被臭氧处理显著提升，这表明臭氧可能加剧了柠檬果实的衰老进程。
研究人员分析，造成这种结果的原因可能是多方面的。冷杀菌本身的低温胁迫已对果实构成压力，而臭氧作为一种强氧化剂，会额外诱导活性氧的产生，造成氧化应激。这种“双重压力”可能超出了果实防御系统的承受范围，反而破坏了细胞膜和果皮的完整性（表现为LOX活性升高和可能的表皮崩溃），为病原菌侵染打开了方便之门，最终导致腐烂率上升。尽管CAT和GR等酶被激活试图“救场”，但可能不足以抵消氧化损伤。此外，臭氧处理可能改变了果实表面的微生物群落，在杀灭部分微生物的同时，使得耐臭氧的微生物得以增殖，从而加剧腐烂。
因此，该研究强调，将气态臭氧作为柠檬采后处理，特别是在与冷杀菌结合使用时，需要极为谨慎。当前研究中采用的臭氧浓度和处理时间（尤其是48小时）对‘尤力克’柠檬的品质维持和腐烂控制产生了负面影响。这项研究的重要意义在于，它没有简单重复臭氧在其他果蔬上的正面效果，而是通过精细的实验设计，揭示了在特定（且非常重要的商业）储存条件下，臭氧处理对柠檬可能产生的潜在风险。它提醒产业界和科研人员，任何一种新技术的应用都必须充分考虑作物种类和特定储存环境的特殊性。研究团队在文末建议，未来的研究应致力于探索更短的臭氧暴露时间，并重点关注臭氧如何影响致腐病原菌以及POD和LOX等与衰老紧密相关的酶，以优化臭氧处理参数，在发挥其杀菌优势的同时，最小化其对柑橘类水果品质的损害，最终推动臭氧成为一种安全高效的柑橘采后处理技术。
