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本文通过近900个五种鲸类的皮肤样本，系统评估了脂质提取（Folch法）对δ15N值的富集效应，并建立了跨物种的线性校正模型。研究证实，脂质提取会导致δ15N值平均升高0.29‰，其影响存在个体差异，可能干扰营养级关系解读。所提出的物种特异性与全局数学模型可精准预测未提取样本的δ15NNE值，为历史样本校正及小样本量研究提供了高效、低成本的解决方案，尤其适用于原料缺失的回顾性研究。
文章内容归纳总结
引言
稳定同位素生物标志物是研究野生动物摄食生态与营养生态位的重要工具，其中碳(δ13C)和氮(δ15N)稳定同位素比值可提供关于碳源、栖息地利用、营养关系及饮食组成的信息。皮肤活检因其易于从自由活动的动物获取，已被广泛用于鲸类的稳定同位素研究。皮肤是代谢活跃的组织，其表皮含有丰富的角质蛋白，能够整合采样前数月的饮食信息，但同时也含有相当量的脂质。由于脂质相对于蛋白质和碳水化合物组分贫化13C，高脂质含量可能对δ13C值及其在评估饮食组成和营养关系时的解读产生负向偏差。因此，在δ13C分析前进行脂质提取已成为常规操作。
过去，通常假定脂质的化学提取不影响δ15N值，并常从同一份脂质提取后的等分样品中进行δ13C和δ15N分析。然而，多项对不同物种和组织的研究已记录脂质提取后会导致15N显著富集，这可能源于提取过程中特定氨基酸的流失以及贫15N的含氮废物的共淋洗。因此，目前推荐的方法是从脂质提取(LE)的等分样品估算δ13C，从未提取(NE)的整体样品获取δ15N。但这种方法不仅成本高、耗时且劳动密集，在活检样本量小或需进行其他类型分析时可能不可行或并非最优选择。
利用数学模型从脂质提取后的样品(δ15NLE)校正恢复未提取样品的δ15N值(δ15NNE)已被证明是多种脊椎动物类群的可靠选择。这种方法对于追溯性校正现有脂质提取样品（其原始材料可能已不存在）尤为有用。本研究基于Lesage等人的工作，大幅扩展了样本量，旨在评估脂质提取对五种鲸类皮肤δ15N值的影响，并提出并验证物种特异性和多物种（全局）数学模型，以从脂质提取样品中估算δ15NNE值。
方法
研究使用了1998年至2023年间在加拿大圣劳伦斯河口和海湾收集的863个皮肤样品，涉及白鲸、蓝鲸、小须鲸、长须鲸和座头鲸五种物种。样品来自尸体监测计划或远程活检采样。所有样品的表皮均与真皮及下层脂肪分离，冻干并研磨成细粉，然后分成两份等分样品。一份不进行任何处理，另一份使用Folch法进行脂质提取。
碳氮稳定同位素使用元素分析仪耦合同位素比质谱仪进行测量。同位素丰度以δ表示法表示，仪器精度对δ13C为±0.2‰，对δ15N为±0.3‰。通过随机重复分析估计的样品精度平均差异为δ13C 0.1‰，δ15N 0.2‰。
脂质提取对δ15N值的影响计算为脂质提取与未提取等分样品之间的差值(ΔN)。使用置换多元方差分析比较物种间及样品来源间的差异。评估了采样日期对ΔN、未提取样品碳氮比(CNNE)和提取后碳氮比(CNLE)的影响。为预测δ15NNE，开发了包含所有物种的全局模型和每个物种的特定模型，候选模型包括是否使用δ15NLE和CNLE作为协变量，以及是否将采样年份作为随机因子。通过均方根误差、平均绝对误差和R平方系数评估模型性能。最后，使用来自同一或其他环境的另外三个物种（港湾鼠海豚、北极白鲸、虎鲸）的数据集验证了全局模型和特定物种模型的可推广性。
结果
脂质提取对δ15N值的影响
脂质提取对所有物种的δ15N值均有影响，导致整体平均15N富集0.29‰ ± 0.41‰，这相当于基于实验室标准的仪器精度上限(±0.3‰)。然而，所有物种合并时有33.7%的样品超出了此范围。除蓝鲸外，脂质提取对δ15N的平均影响在所有物种中相似，蓝鲸的ΔN显著更高，为0.40‰。脂质提取的效果不因样品是通过自由活动动物活检还是尸体采集而不同。未检测到样本量对ΔN变异有显著影响。
CNNE、CNLE和ΔN值的时间趋势
各物种在ΔN值、CNLE或CNNE随时间变化方面未检测到一致的模式，且通常只有相对较小部分的方差或偏差可由线性或非线性模型解释。座头鲸在所有三个变量中均检测到正向时间趋势，小须鲸的ΔN和CNNE随时间线性下降，白鲸的CNLE随时间下降，长须鲸的ΔN随时间线性增加。
脂质标准化模型
无论考虑所有物种还是单个物种，最拟合数据的模型始终仅包含变量δ15NLE。将CNLE作为协变量并未改善任何模型的拟合度。然而，将采样年份作为随机因子与δ15NLE一同纳入，确实改善了座头鲸的模型拟合度，尽管相关的解释偏差增加有限。
模型性能
全局模型和物种特异性模型均能以高精度从δ15NLE预测δ15NNE，预测值与观测值之间的平均差异接近于零。总体而言，74%（全局模型）和超过76%（物种特异性模型）的预测值落在仪器精度范围(±0.3‰)内。然而，对于北极白鲸，全局模型比物种特异性模型更准确。
使用全局模型预测港湾鼠海豚的δ15NNE，结果90%的预测值与观测值差异落在仪器精度内。但对于虎鲸和北极白鲸，模型性能较差，分别只有67%和44%的预测值在仪器精度内。使用白鲸特异性模型并未改善对北极白鲸的预测。
讨论
脂质提取对δ15N值的影响
本研究记录了所有测试鲸类物种在脂质提取后均出现显著的15N富集。平均富集水平接近基于内标的典型仪器精度(±0.3‰)。然而，脂质提取的效果在个体间差异很大，在某些情况下可能大到足以改变对营养关系、营养级位置或使用同位素混合模型的饮食估算的解读。脂质去除的效果在物种间也不均匀，即使是近缘物种。鉴于所有样品均使用相同的Folch程序进行脂质提取，观察到的变异很可能源于物种间皮肤组成的差异。从进化角度看，水生皮肤适应在不同鲸类物种中独立演化，皮肤结构和厚度的差异可能导致处理过程中的变异。脂质提取被认为通过溶解作用改变δ15N值，即溶剂对氨基酸的提取或共提取。因此，脂质提取对δ15N值的影响取决于所用溶剂的极性和使用方法。
脂质标准化模型
全局模型和物种特异性模型均能以高精度从皮肤样品的δ15NLE值预测δ15NNE值。与模型预测相关的平均误差与基于实验室标准的仪器精度相当。数学模型校正的有用性在很大程度上取决于其相对于传统方法（对δ13C和δ15N使用单独等分样品进行分析）的精确度和准确度。在潜在猎物源δ15N值差异较大的系统中，全局模型预测引入的误差平均小于猎物源间观测δ15N梯度的1%，在最极端情况下可达40%。在这种情况下，建模方法不太可能显著影响饮食估算或营养关系的结果。在猎物差异很小且需要更高精度的系统中，则可能需要对单独等分样品进行分析，以将分析误差控制在至少比自然同位素景观变异低三倍的水平。
全局模型成功扩展到同样在圣劳伦斯生态系统取样的港湾鼠海豚，表明该模型很可能可以放心地用于该地区的其他鲸类物种。当扩展到在北极取样的动物时，EGSL全局模型性能的下降，以及这可能源于暴露于不同环境条件的可能性，值得进一步分析。尽管如此，全局模型对北极白鲸和虎鲸仍然相对有效，使其在缺乏物种特异性模型时成为一个潜在可接受的选择。
结论
本研究证实，脂质提取对五种鲸类皮肤δ15N值具有不可忽视的影响，并提供了物种特异性和多物种模型，用于从脂质提取样品中可靠地预测整体δ15N值。所提出的数学校正为元素特异性同位素分析提供了一种经济高效的替代方案，并为追溯性校正原始材料可能已不存在的现有脂质提取样品提供了有价值的工具。在数学模型校正与对两种化学元素使用单独等分样品进行分析之间的最终选择，可能取决于猎物同位素景观的变异以及解决研究问题所需的分辨率。
