综述：液相色谱中“总可及体积”与“滞留体积”的再定义与测量：当前理解与进展

《Journal of Chromatography A》：Revisiting The Definition and Measurement of Total Accessible and Hold-Up Volumes in Liquid Chromatography: Current Understanding and Advances

本综述聚焦液相色谱核心参数——保留因子（k）计算所依赖的参考体积VM,ref。文章系统回顾了其两种主流定义：总可及体积（VM,tot，柱内全部溶剂可及空间）与滞留体积（VM,0，不被保留分析物可及体积）。通过比较静态（如比重法）与动态（如微小扰动法）测定方法，并结合分子动力学模拟等新证据，文章旨在澄清定义模糊性，统一术语使用，并为反相（RPLC）和亲水（HILIC）色谱模式下的体积测定提供最佳实践建议。

　　

在液相色谱领域，准确计算分析物的保留因子（k）是一个基础却又充满争议的核心课题。这一切争论的源头，都指向了k值计算公式中那个看似简单的分母——参考体积V_M,ref（或对应时间t_M,ref）。这个体积的定义，直接决定了我们对分析物与固定相互作用的量化是否准确、可比。目前，学术界对此主要存在两种理解路径，它们分别对应着两种不同的体积定义。

一、 统一当前实践中的定义

纵观文献，对V_M,ref的界定可以归纳为两大类，这主要源于对柱内“空”空间的不同理解。

第一种定义，是将V_M,ref等同于整个色谱柱在键合相涂覆后（如果存在的话）的总可及空体积，本文将其明确为总可及体积V_M,tot。其构成包括颗粒间的间隙体积V_interstitial，以及颗粒内部对所有溶剂分子都可及的体积V_M,part。用公式表示为：V_M,tot= V_interstitial+ V_M,part。

第二种定义，则关注于那些在色谱过程中真正“流动”的部分，即不被保留的分析物所能接触到的流动相体积。这个体积被称为滞留体积V_M,0，或者叫“死体积”。它特指那些不被保留的分析物在洗脱过程中实际占据的流动相空间。

这两种定义的差异，关键在于如何看待键合相表面吸附的那一层溶剂。例如，在反相色谱中，疏水的固定相与含有机改性剂的水性流动相接触，会在固定相表面形成一个富有机溶剂的吸附层；而在亲水作用色谱中，情况正好相反，极性固定相与富有机溶剂的流动相作用，会形成一个富水的固定化水层。这些吸附的溶剂，究竟应该被视为固定相的一部分，还是流动相的一部分？对这个问题的不同回答，直接导致了V_M,tot和V_M,0的分离，也使得不同方法测得的保留参数可能存在系统偏差，给跨柱子、跨系统、跨实验室的色谱分析结果比较带来了固有的不确定性和复杂性。

二、 总可及体积的测定方法概述

测定总可及体积V_M,tot主要有两大类方法：静态法和动态法。

最著名的静态法是比重法或称重量差法。这种方法通过测量色谱柱在不同溶剂中（通常是干燥状态和充满溶剂状态）的质量差，结合溶剂的密度来计算柱内总体积，进而扣除固定相骨架体积后得到总孔隙体积。

动态法的代表则是微小扰动法。该方法通过向流动相中注入一个微小的组成扰动（例如改变有机改性剂比例），并监测这个扰动通过色谱柱的时间。由于这种扰动理论上不与固定相发生特异性相互作用，其洗脱时间对应的体积，通常被认为反映了整个流动相可及空间，即接近于V_M,tot。

三、 滞留体积的测定方法概述

滞留体积V_M,0的测定同样依赖于多种动态方法，常用工具包括小的、不被保留的中性标记物、无机或有机盐类以及同系物等。但需要注意的是，即使使用同一种测定方法，如果选用不同的不被保留标记物，所得的V_M,0值也可能存在高达30%的相对误差。这种误差会导致对保留机制和热力学参数的误解。因此，统一V_M,0测定的实验方法论至关重要，尤其是在比较不同研究的数据时。

四、 替代方法与不同分离模式

除了传统实验方法，分子动力学模拟、蒙特卡洛方法和迎头分析法等工具为探究固定相中溶剂吸附层的存在与范围提供了更深入的视角。

分子动力学模拟通过计算原子和分子的运动轨迹，能够从微观层面可视化并量化溶剂分子在固定相表面的吸附行为、层厚度以及动态交换过程。模拟结果强有力地证实了在反相和亲水作用色谱的固定相表面，确实存在一层组成高度富集的溶剂层（反相色谱中富有机溶剂，亲水色谱中富水）。蒙特卡洛方法则通过随机采样来研究系统的平衡态性质，为理解溶剂吸附的热力学提供了补充信息。这些计算研究的结果与传统实验方法的发现相互印证，共同支撑了关于溶剂吸附层复杂性的核心观点。

五、 结论

总可及体积与滞留体积的测定，是液相色谱中基础而复杂的问题。分子动力学模拟和实验研究均已证实，部分流动相分子会被吸附或融入固定相，这使得清晰划分流动相与固定相的边界变得模糊。本综述主张明确区分两个术语：将所有溶剂分子均可及的柱内总体积定义为“总可及体积”，而将不被保留的分析物可及的流动相体积定义为“滞留体积”。未来的研究需要致力于建立标准化的、普遍接受的测定协议，并明确报告所使用的体积定义。在解释保留因子k、比较不同色谱系统或进行热力学分析时，必须考虑所选参考体积定义所带来的影响，以促进色谱科学获得更一致、更可靠、可重复的结果。