《Sustainable Food Technology》：Colored avocado (Persea americana Mill.) seed extract using a natural deep eutectic solvent for potential sustainable food coloring applications: towards a circular bioeconomy
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本文综述了利用天然低共熔溶剂（NADES）从牛油果籽中绿色提取有色化合物（CASE）的研究。研究表明，甘油:乙酸钠（Gly:NaOAc, 3:1）NADES能高效提取出高得率、富含多酚、具有抗氧化活性且无细胞毒性的CASE，其pH依赖的显色特性与稳定性使其有望成为合成橙红色食品着色剂的可持续替代品，契合循环生物经济理念。
1引言
牛油果（Persea americanaMill.）的全球消费与产量持续增长，预计到2030年全球产量将达到1200万吨。这一增长产生了大量的农业工业残留物，主要是果核和果皮，这些废弃物如不妥善处理会带来环境问题，但其本身也是生物活性化合物的丰富来源。通过级联生物精炼和绿色加工方法对这些副产物进行增值化利用，支持高附加值生物产品的可持续生产，并促进循环生物经济的发展。本研究探索了从牛油果籽中提取天然着色剂，作为合成橙红色食品着色剂的潜在环保替代品。使用热蒸馏水、70%乙醇（回流）以及甘油:乙酸钠（Gly:NaOAc, 3:1）天然低共熔溶剂（NADES）从Fuerte和Hass品种的牛油果籽中制备了有色牛油果籽提取物（CASEs）。在提取前，将籽浆暴露在空气中35分钟，以促使多酚氧化酶（PPO）介导的颜色形成。水提和醇提得到了干燥粉末，而Gly:NaOAc (3:1) NADES则产生了一种稳定的、即用型液态CASE/NADES，其得率（以最终液体系统质量相对于初始干籽质量计算）很高（Hass为88.6%，Fuerte为88.2%）。CASEs在480 nm处有最大吸光度，并用柠檬黄当量进行定量。CASE/Gly:NaOAc NADES配方在pH 3-7范围内表现出pH依赖的颜色稳定性，并在不同储存和光照条件下保持了色彩完整性。以μmol铜还原当量（CRE）每毫升表示的抗氧化能力，在乙醇提取物中最高（Fuerte品种为3980.33，Hass品种为1980.33），其次是NADES提取物，分别为934.61和736.56 CRE每毫升。CASE/(Gly:NaOAc 3:1) 体系在碱性条件下颜色加深，在光照和黑暗储存条件下均保持稳定。当使用Gly:NaOAc (3:1) NADES提取时，总酚含量（TPC）达到Hass品种203.45 mg GAE/100g鲜重和Fuerte品种171.92 mg GAE/100g鲜重。对人皮肤成纤维细胞的细胞毒性试验（MTT法）证实，CASE/(Gly:NaOAc) 3:1 NADES体系无毒，可能适合作为天然食品着色替代品。将牛油果籽绿色增值转化为功能性着色剂，为减少废物、开发生物产品和建立新的工业价值链提供了一条有前景的途径，支持了韧性循环生物经济的推进。
2材料与方法
2.1材料与试剂
实验使用来自厄瓜多尔的Hass和Fuerte品种牛油果。所有提取制备用试剂均为食品级。甘油、乙醇、乙酸钠和氯化胆碱等购自指定供应商。抗氧化活性测定使用商业OxiSelect? TAC试剂盒。总多酚测定使用Folin–Ciocalteu试剂、碳酸钠和没食子酸。
2.2牛油果籽选择、Gly/NaOAc 3:1 NADES合成与提取制备
牛油果经清洗、去核、切块后，与0.7体积蒸馏水混合打成均匀籽浆。将籽浆铺开（约1 cm厚）并在空气中静置35分钟，以激活多酚氧化酶（PPO）促发颜色形成。随后使用蒸馏水、70%乙醇和Gly/NaOAc (3:1) NADES三种溶剂进行CASE提取。水提和醇提采用加热（70 °C, 120 min）后浓缩干燥得粉末。NADES的合成按文献方法将甘油与乙酸钠按3:1摩尔比在70 °C下搅拌加热45分钟制得澄清液体，使用时用水稀释至90%（v/v）。NADES提取采用渗滤法，条件与水/醇提相同（70-80 °C水浴，120 min）。提取后混合物经真空过滤、离心，上清液即为CASE/NADES即用液体提取物。提取得率计算方式不同：水/醇提为干燥粉末质量与所用牛油果籽质量之比；NADES提为上清液中回收的CASE/NADES液体部分质量与初始牛油果籽浆质量之比。为进行光谱分析，NADES提取物用蒸馏水按2:1（v/v）稀释以降低粘度。
2.3多酚含量测定
采用Folin–Ciocalteu法测定总多酚含量。将稀释的提取物与试剂混合，加入碳酸钠溶液，孵育2小时后在760 nm测吸光度。使用没食子酸溶液制作标准曲线，结果以没食子酸当量（GAE）表示。
2.4总抗氧化能力
使用“OxiSelect? TAC”试剂盒，按照说明书通过比色法测定总抗氧化能力。样品在测定前离心并于4 °C储存24小时。在490 nm测量吸光度，并使用尿酸标准品制作标准曲线。
2.5动力学、pH与稳定性
2.5.1动力学
为评估显色动力学，将牛油果籽浆在提取前暴露于空气不同时间（0.5 至 40 分钟）。随后进行提取，将所得上清液离心、稀释，在480 nm记录吸光度。该动力学分析专门对应于籽浆的空气暴露期（与PPO介导的氧化相关），而非提取过程本身。
2.5.2pH依赖性颜色响应
为确保可比性，所有CASE样品在pH调整前均通过稀释归一化至相同的初始吸光度（A480= 0.30 ± 0.02）。将归一化后的CASE溶液与不同pH值（2, 4, 6, 7, 9, 10）的PBS缓冲液按2:1体积比混合，离心后在480 nm记录其吸收光谱。
2.5.3稳定性测定
对于稳定性测试，所有提取物同样在PBS（pH 7.5）中归一化至A480= 0.30 ± 0.02（第0天）。样品在密封管中于不同温度（4 °C和25 °C）和光照条件（明/暗）下储存。在15天内每日测量吸光度，结果以A/A0表示，其中A0为第0天归一化样品的吸光度。
2.6细胞毒性评估
评估了水提和醇提CASEs对两种牛油果品种的细胞毒性，而CASE/Gly/NaOAc (3:1) NADES体系仅针对在全球商业中占主导地位的Hass品种进行了测试。用含有不同浓度CASEs（5 至 0.0005 mg mL-1）的培养液处理从人皮肤活检中分离的原代成纤维细胞。通过MTT法评估处理24小时和48小时后的细胞活力。所有测定均进行五重复。
2.7CASE/Gly:NaOAc NADES体系作为天然着色剂在酸奶中的应用评估
进行了初步实验，评估CASE/Gly:NaOAc NADES体系作为即用型天然着色剂在乳制品中的应用潜力。向三种商业品牌天然酸奶中各加入1 mL该CASE/NADES体系至100 mL酸奶中，轻柔混合至颜色分布均匀。以未处理的同品牌酸奶作为对照，评估颜色变化。所有酸奶样品用蒸馏水1:10（v/v）稀释以降低浊度，离心取上清液，在400-700 nm范围内记录可见吸收光谱，以确定最大吸收波长并评估颜色变化。同时测量了样品的密度和pH。
2.8统计分析
所有定量变量（得率、吸光度、浓度、抗氧化能力）均采用双因素实验设计进行评估。固定因素为溶剂和牛油果品种，每个处理三个重复。数据在满足正态性和方差齐性假设后，进行双因素方差分析，若存在显著差异则使用Tukey's HSD检验进行两两比较。稳定性数据因不满足参数检验假设，使用Kruskal-Wallis检验评估差异。所有分析在Minitab? 19.1中进行。
3结果与讨论
3.1提取得率
视觉上，水提CASEs呈透明橙色，醇提CASE颜色更浓，呈更强烈的橙色，而CASE/Gly:NaOAc (3:1) NADES体系则呈现鲜艳的红橙色。方差分析显示溶剂类型对CASE得率有显著影响，而品种间无统计学差异。Tukey检验将样品分为三个显著不同的组：A组（得率最高），使用Gly/NaOAc (3:1) NADES渗滤提取（Hass 88.6%；Fuerte 88.2%）；B组，70%乙醇回流提取（Hass 19.0%；Fuerte 13.0%）；C组，70 °C热蒸馏水提取（Hass 8.0%；Fuerte 2.6%）。NADES体系的高得率归因于形成了高浓度的CASE/NADES液体体系，无需干燥或浓缩，可直接作为即用产品。在480 nm处的吸光度（作为颜色强度的定性指标）也显示显著差异，NADES和醇提的吸光度最高，水提最低。需注意，图中吸光度值反映的是各提取体系工作浓度下的颜色强度，并非用于溶剂间定量比较提取效率，提取效率基于重量得率和校准的CASE浓度进行评估。
3.2红橙色CASEs的浓度
CASEs的颜色浓度通过紫外-可见分光光度法测定。所有样品在480 nm处均有最大吸收峰。使用柠檬黄校准曲线在480 nm进行定量分析，结果以柠檬黄当量（ppm）表示。在70%乙醇提取物中，Hass品种浓度为2210 ppm，Fuerte为1310 ppm。使用Gly:NaOAc (3:1) NADES提取的CASE在Hass品种中表现出更高的吸光度（0.460），超过了水提和醇提CASEs。统计分析证实，品种间和溶剂间均存在显著差异。Hass品种的CASEs浓度高于Fuerte品种，而Gly:NaOAc (3:1) NADES与70%乙醇和蒸馏水有显著差异，后两者间无显著差异。NADES提取物浓度性能增强可能归因于其略带碱性的pH、相对于纯甘油降低的粘度、以及有利的极性-溶解度平衡。虽然本研究未分离纯化色素，但已有文献从CASE中分离出分子式为C29H30O14的糖基化苯并卓酚酮衍生物作为主要黄橙色固体色素。
3.3动力学、pH与稳定性
牛油果籽中PPO的活性是其在氧气存在下氧化形成特征性红橙色的原因。动力学分析显示，牛油果籽浆暴露于空气的时间越长，橙色显色强度越高。CASE/Gly:NaOAc (3:1) NADES体系在空气暴露初期（2-5分钟内）吸光度增加更快，而乙醇体系则表现为更缓慢的初始上升和更渐进的进程。这表明NADES介质在提取阶段能更快地稳定和增溶氧化产生的发色中间体，而非改变了PPO的反应动力学本身。随着pH从2升高到10，CASE在480 nm处的吸光度逐渐上升。视觉上，CASE在酸性pH 2-6时呈淡黄橙色，在中性pH 7-8时呈亮橙粉色，在碱性pH 9-11时呈深红橙色。CASE/Gly:NaOAc NADES体系在pH 2-8范围内的吸光度增长较为平缓，这可能是由于乙酸钠的缓冲效应和NADES的高粘度减缓了反应动力学。这些结果表明CASE/Gly:NaOAc NADES体系的着色与花色苷无关，因为花色苷在pH ≤ 3时呈橙红色，在pH 6-7时因去质子化而变为蓝色，在更高pH下会降解。相反，该体系在食品典型的pH范围（pH 3-7）内保持稳定，使其成为有前景的替代品。例如，将其加入酸奶（pH 4.4-4.6）产生橙色色调，加入牛奶则产生粉红色调。稳定性测试显示，除蒸馏水提取物在室温光照下在15天前失去颜色稳定性外，大多数CASEs在光照和黑暗条件下均能保持颜色稳定性15天。其中，CASE/Gly:NaOAc (3:1) NADES在不同储存条件下表现出最佳的长期稳定性。稳定性分析表明，溶剂类型是影响A/A0值的主要因素，储存温度也有显著但较弱的影响，而光照条件无显著差异。A/A0比值大于1可能表明在相同或相近波长处有降解产物形成，导致吸光度短暂变化。
3.4总多酚含量（TPC）测定
在本研究中，当使用Gly:NaOAc (3:1) NADES作为提取溶剂时，Hass品种CASE样品中的多酚含量最高，其次是Fuerte品种，其值分别为203.45和171.92 mg GAE/100g鲜重，显著高于使用其他溶剂评估所得的值。类似趋势此前已有报道，使用胆碱氯:乳酸（2:1）低共熔溶剂从牛油果皮中提取得到了高多酚含量。因此，溶剂选择是控制酚类化合物提取效率的关键因素，低共熔组成、pH和粘度等参数强烈影响提取性能。
3.5抗氧化活性
本研究中，CASE/Gly:NaOAc (3:1) 体系样品的最高抗氧化活性，通过TAC测定，Fuerte提取物为3980.33 μmol Cu2+还原当量每毫升，Hass品种为1980.33 μmol Cu2+还原当量每毫升。牛油果品种和提取溶剂均显著影响抗氧化能力。Fuerte品种的抗氧化活性高于Hass品种。同样，使用NADES获得的提取物其抗氧化能力显著高于乙醇和蒸馏水提取物，而后两者间无显著差异。480 nm处吸光度与抗氧化能力之间的关系并非严格线性，且受溶剂和牛油果品种的显著影响。在水提物中，相对较高的吸光度值与较低的抗氧化活性相关，表明颜色强度本身并不能可靠反映生物活性。相比之下，使用Gly:NaOAc (3:1) NADES获得的提取物对两个品种都表现出最高的抗氧化能力，即使其吸光度值与乙醇提取物相当或更低。这些发现表明，低共熔溶剂提高了多酚提取效率，并有助于保持抗氧化功能。
3.6细胞毒性
甘油和乙酸钠在低浓度使用时通常被认为无毒，但仍需评估本研究合成的Gly:NaOAc (3:1) NADES及其掺入食品基质后的潜在毒性以确保产品安全。对于Fuerte品种的CASE样品，在测试浓度范围（0.0005 至 5 mg mL-1）内，暴露24小时和48小时后，与对照相比，各浓度间细胞活力均未观察到显著差异。对于Hass品种的CASE样品，水提物在暴露24小时和48小时后均未表现出细胞毒性作用，而醇提物仅在24小时内无细胞毒性。暴露48小时后，浓度高于0.5 mg mL-1的醇提物诱导了细胞毒性，导致细胞活力适度降低。这种在48小时观察到的细胞毒性
