《Botany》：Non-glandular trichomes (epidermal hairs) in cannabis (Cannabis sativa L.) plants are capable of excreting nutrient salts under excessive fertilizer regimes
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本文首次揭示了大麻（Cannabis sativa L.）营养组织中的非腺毛（表皮毛）具备在过量施肥条件下排泄多种营养盐离子的能力。通过电镜与X射线微区分析证实，盐分以螺旋状细丝形式从毛状体顶端及侧壁小孔排出，形成白色晶体，这为研究植物对盐分/养分胁迫的耐受性及重金属离子隔离提供了新视角。
摘要
在水培大麻（Cannabis sativaL.）植株的叶片上观察到类似病原菌侵染的斑点与枯萎症状。对病组织进行全基因组测序和真菌特异性引物聚合酶链反应（PCR），均未发现潜在的病原微生物。对受影响组织的显微观察揭示了白色粉末状结晶物质的持续存在。X射线微区分析证实晶体含有钙、钠和多种其他阳离子以及氯离子。这些盐分直接来源于茎和叶上非腺毛的顶端和侧壁。盐分在毛状体基部聚集成白色晶体斑块，尤其在叶脉和茎上。用过量营养盐处理植株可产生类似症状。本研究首次描述了大麻非腺毛在过量施肥条件下排泄营养盐的能力。这些毛状体在将环境中有毒水平的营养盐运输出植株以及增强耐盐性方面的潜在作用值得进一步研究。
引言
大麻是加拿大大麻科的一种植物，2018年合法化后，出于药用和娱乐目的，在多个地区的温室和受控环境条件下种植。水培法用于提供受控的营养盐方案以实现最佳植物生长。目前大部分研究重点在于优化植物营养以增加大麻素和萜烯的产量，这些是主要的活性化合物。相比之下，营养组织（包括叶、茎、叶柄）上大量产生的非腺毛（也称为叶毛）获得的关注要少得多。在2024年，一家持证温室大麻生产设施的常规种植过程中，在基因型PG上观察到了先前未报道的症状。症状包括叶斑、叶坏死、叶片枯萎以及萎蔫，均类似于病原菌感染所致。此外，茎上出现浅白色斑块，类似于白粉病病原菌引起的感染。这些症状在植株从营养生长（光照周期18:6小时）转入诱导雌花形成的开花室（光照周期调整为12:12小时）后的最初5-10天内出现，并在随后2-3周内持续出现，之后严重程度降低。
鉴于这些症状的特殊性，本研究旨在：（i）将观察到的症状学与已报道的影响大麻的病原菌症状进行比较；（ii）利用PCR、全基因组测序后的微生物组分析以及在琼脂培养基上培养病组织来确定潜在病原菌的存在；（iii）利用光学和扫描电子显微镜观察症状的进展；（iv）尝试通过对照研究重现症状。
材料与方法
受影响植株的症状学
自2024年9月起，对多达30株水培种植的大麻基因型“PG”（一种高四氢大麻酚（THC）品系）进行了观察。这些植株在转入开花室约5天后，少数叶片开始出现斑点，一些嫩枝开始萎蔫并坏死。植株茎部出现明显的白色表层外观。在为期2-3周的时间内，相同植株和其他植株（总计约40株）上症状持续发展；在移植后约4周症状消退。在类似的生长条件下，于2024年10月，在第二个大麻基因型“BA”上，在放入开花室大致相同时间后也观察到了类似症状。症状在首次出现约4周后不再明显，因先前受影响的叶片干枯脱落。在两个种植周期中，大约50株植株受到影响。
受影响组织的取样
从肉眼可见的病植株获取了有症状的组织，包括嫩枝、茎、叶柄和幼叶（移植后10天）及老叶（移植后20天）。使用真菌特异性引物对总DNA进行PCR扩增。此外，对症状组织进行下一代测序（NGS）以评估与症状组织相比无症状组织中是否存在主要的潜在真菌或细菌病原体。还将症状组织在琼脂培养基上培养以分离可能与症状相关的微生物。将症状组织在匀浆后或组织片段直接接种到两种琼脂培养基上。将从培养物中高频出现的真菌和细菌菌落进行亚培养和鉴定。将特定的真菌和细菌分离株用于大麻基因型“PG”离体叶的致病性测定。
光学和扫描电子显微镜观察
首先在解剖显微镜下观察并拍摄叶斑和茎部白色表层组织样本。随后，从四株有症状植株上取最多20块组织样品，空气干燥后，进行扫描电镜处理。在SEM观察中，特别注意了与观察到的症状相关的组织破坏或视觉变化的证据。还记录了与表现症状的组织相关的非腺毛的发生、形态和分布。对SEM下观察的选定样品也进行了X射线能谱（EDX）分析，以鉴定样品中的元素组成。
椰糠生长介质中养分含量和物理特性的分析
获取了生长有病植株的椰糠生长介质样品，并与从未表现症状植株上采集的类似样品以及从未生长过植物的湿润椰糠袋中采集的样品进行比较。将样品送至实验室进行全面的养分分析、水分含量、有机质含量和pH值测定。
在大麻组织上重现症状
为了研究过量施肥盐分是否可能导致本研究中观察到的伤害，获取了在商业生产中使用的肥料溶液。该溶液包含钙、氮、钾、磷酸盐、镁、锰、硫、硼、锌、铜、钠、氯和铁。实验中使用未稀释的混合液，代表约5倍于标准生长条件的营养盐水平。在大麻基因型“PG”上进行了多项实验，包括在离体叶上滴加肥料溶液、将插条基部浸入溶液、将已生根的营养插条根系浸入溶液、对小型营养植株喷施/浇灌溶液，以及对开花室中植株进行灌根处理。处理后观察症状发展，并对产生症状的叶和茎组织进行显微观察。
结果
受影响植株的症状学
转入开花室3-4周后，几株PG基因型植株开始表现萎蔫、新梢回枯和叶片坏死的症状。叶片出现从叶缘开始并融合成较大坏死区的可见斑点。近距离观察这些植株，发现茎部尤其呈现出白色粉末状外观。新发育的叶片表现出多种症状，包括单独斑点的形成，可伴有或不伴有深棕色边缘，以及类似叶枯病的大型坏死区域。坏死区域沿叶脉发展，并出现白色粉末状斑块。在植株活跃生长部位，嫩梢尖端枯死，叶柄、茎和叶片出现白色粉末状斑块。在某些叶片上，观察到被深棕色至黑色边缘包围的大型坏死区域，类似于叶斑真菌或细菌引起的症状。坏死区域沿叶脉发展，在叶脉上观察到白色粉末状物质。在较高倍数的解剖镜下，沿叶脉形成了大的白色晶体斑块，这些斑块似乎从叶脉向外扩散，形成明显的白色区域，并常伴有坏死病斑。
微生物的分离
对有叶斑和茎部症状的组织提取的总DNA进行PCR，结果显示与症状叶片样本对应的泳道缺少条带，表明不存在真菌。对症状组织进行NGS分析，也未发现存在可能导致所观察症状的已知植物病原物种。将症状茎和叶组织直接接种到琼脂培养基上，茎组织周围未出现真菌生长，反而在茎段周围出现了白色晕圈，表明有物质渗出并在琼脂中形成白色沉淀。接种症状叶组织产生了一些真菌菌落，鉴定为青霉、链格孢、曲霉、枝孢和附球菌属。对受影响的组织匀浆后接种到营养琼脂培养基上，得到一些细菌菌落，鉴定为假单胞菌、鞘氨醇单胞菌和芽孢杆菌属，还有一个酵母菌落鉴定为迈耶氏酵母属。所有这些分离株在离体叶致病性测试中均未引起病斑或产生与病斑相关的白色粉末状物质。
无症状组织的光学和扫描电子显微镜观察
对无症状茎和叶组织的非腺毛形态进行光学显微镜观察，发现它们在新生茎表面、新生叶片下表面的叶脉沿线以及更成熟植株的茎上大量产生。SEM观察显示，非腺毛在新生叶片下表面，特别是中脉沿线大量发育。近距离观察显示这些毛状体大小不一，基部宽，向尖端逐渐变细。许多毛状体表面粗糙，尤其是靠近尖端处。在更成熟叶片的下表面，非腺毛较少，具有明显的膨大基部和长的渐尖尖端。除了这些叶毛，还观察到无柄腺毛散布在非腺毛之间。在光学显微镜下，毛状体最初表现为离散的不透明点，在叶脉沿线和新生叶片下表面大量形成。在SEM下，非腺毛显示出不同的发育阶段，许多形成尖状柄，而其他仅形成基部。毛状体表面观察到突起或“疣突”，围绕基部呈同心圆状排列。随着毛状体继续发育成熟，突起出现的频率和复杂性似乎增加。大多数这些有柄毛状体存在于下表皮。在一个特定的叶样本中，上表皮的一个短的孤立毛状体与下表皮大量较长、基部不太发达的毛状体形成对比。对孤立毛状体的放大观察显示，毛状体基部内存在致密的晶体状物质。
症状组织的光学和扫描电子显微镜观察
对有症状叶和茎组织进行不同倍数的光学显微镜观察，以确定受大麻植株症状的性质。在新发育的有症状叶片的上表面，特别是在叶脉沿线，观察到白色结晶物质的小簇，呈现为点状。在包含坏死病斑的叶样本中，观察到白色结晶物质沿中脉形成，与下面的坏死组织相关。在SEM下，观察到晶体聚集体散布在非腺毛之间。这些晶体聚集体主要在毛状体基部发现，并发育成簇，类似于观察到的白色聚集体或点。在新发育的茎上，观察到白色粉笔状粉末物质，呈晶体性质，与坏死区域相关。在较高倍数下，白色晶体物质类似于盐分沉积，可清楚地看到与在大麻茎上大量产生的非腺毛相关。晶体聚集体也可直接形成在毛状体上，产生覆盖毛状体的白色晶体沉积。在较高倍数的SEM下，观察到非腺毛的柄从其顶端分泌出线状卷曲结构。放大视图显示白色分泌物卷曲从毛状体尖端分泌出来，有时卷曲形成三维结构。卷曲结构变得折叠和交织，形成意大利面状管，平均直径约1微米。其他SEM观察显示，白色分泌物的卷曲也可直接来源于毛状体柄的侧壁，在许多情况下似乎起源于突起或疣突发育的区域。从毛状体柄壁出现的卷曲在许多情况下看起来是被强行挤出的。更高倍数的观察揭示了毛状体壁上存在微小孔洞，卷曲物质通过这些小孔挤出。开口直径约为0.5微米。随着卷曲物质继续从毛状体柄分泌，它们形成了三维结构，类似于先前在叶表面观察到的晶体聚集体。聚集体继续发展成更大的晶体块，位于毛状体末端，并似乎沿着毛状体柄向下滑动，积聚在基部。晶体物质通过毛状体柄壁挤出的过程得以展示。在毛状体壁的不同点，物质卷曲形成各种形状和大小。在某些情况下，晶体物质似乎沉积在突起或疣突附近，在毛状体表面形成大簇。
X射线微区分析
对已发育分泌物卷曲和晶体聚集体的几个叶样本进行了X射线微区分析。新形成的卷曲被发现含有钙，以及用于包被样品的铱、碳和氧。晶体聚集体被发现含有不同水平的钙、钾、镁、硫、氯和硅，以及铱、碳和氧。与较小的卷曲结构相比，阳离子和阴离子的总浓度在晶体聚集体中更高。在新形成的卷曲和晶体聚集体中，除碳、氧和铱外，钙是所有检测样品中最丰富的元素，其次是钾和氯。在一个样品中检测到硅。
椰糠生长介质养分含量和物理特性分析
比较了三个椰糠样品，以确定其物理特性和养分组成是否存在差异。所有样品的有机质含量、水分水平、碳氮比和pH值都相似。磷、镁、锰和铜的水平在所有样品中也在可比范围内。在生长有病植株的样品中，以下营养物质的水平显著高于生长无症状植株的样品以及无植物的样品：硝态氮、钾、钙、硫、硼、钠和氯。有植物生长的样品中的养分水平通常高于仅接受水分的无植物样品，因为前者提供了促进生长的肥料溶液。生长有病植株的样品中显著较高的养分水平表明它们施肥过量。
在大麻组织上重现症状
将商业浓缩肥料溶液滴加到离体大麻叶表面，在24小时内导致白色沉淀物形成。这种残留物类似于在病植株茎和叶上观察到的白色粉末状物质。将已生根大麻插条插入肥料溶液中，与接受水的对照插条相比，在3天内引起萎蔫、矮化和坏死。1周后，叶片出现坏死病斑，并沿叶脉发展。当实验所用的容器被晾干时，形成了白色粉末状沉淀物，类似于在病植株茎上观察到的粉状覆盖物。当大麻插条基部放置在肥料溶液中并静置4天时，茎上出现白色晶体沉积，表明溶液被吸收。白色沉积物类似于在病植株茎上观察到的沉积物。在较高倍数的解剖镜下，可以看到白色晶体沉积与非腺毛相关形成，覆盖了毛状体柄和基部。这些茎的横截面显示白色晶体沉积在髓周围的髓薄壁细胞内形成，而在光学和扫描电子显微镜下，在单个髓细胞内可以看到白色晶体簇。相比之下，对照茎的髓薄壁细胞内没有晶体。检查这些茎组织的表面，发现了包括卷曲和复杂聚集体在内的晶体结构，其外观与在病植株上观察到的相似。晶体从毛状体柄挤出，并在表面形成大聚集体。未暴露于肥料溶液的对照样品在毛状体上没有任何晶体形成。
讨论
在本研究开始时，水培大麻植株出现的叶斑、叶片枯萎和萎蔫症状，以及伴随这些症状的茎和叶上的白色粉末状斑块，被推测是由一种先前未描述的病原菌引起的。然而，反复尝试分离真菌或细菌病原体，结合分子和微生物组分析以及致病性研究，排除了病原体致病的可能性。随后，光学和扫描电子显微镜研究揭示，晶体聚集体与非腺毛相关产生，并与组织坏死和受影响组织中盐分的积累相关。X射线微区分析证实，肥料溶液中存在的大量阳离子和阴离子也存在于晶体中。此外，生长有病植株的椰糠介质中的几种营养盐水平显著高于含有对照植株的介质，这些盐包括钙、钾、钠和氯。观察到的症状很可能是意外过量施肥导致的组织损伤和坏死。通过在受控条件下将浓缩肥料溶液添加到各种大麻组织上，这些症状得以重现。
本研究中最独特的发现是观察到非腺毛能够从其柄的尖端和柄壁分泌这些过量的营养盐。盐最初以螺旋状细丝的形式挤出，直径约0.5-1微米，这表明角质层和柄尖端的小孔是盐分释放的部位。在一些毛状体上，在角质层中观察到的直径约0.5微米的小孔，为盐分挤出提供了可能的通道。盐分被分泌的方式类似于物理挤压，就像牙膏或糖霜被迫从管子的小开口挤出以产生类似的卷曲线条一样。可能是受影响茎和叶的毛状体内渗透压的积累导致盐分被挤出。在毛状体表面观察到的突起或疣突似乎也是盐分积聚的部位。这些角质层疣突先前曾在大麻的非腺毛中被描述过。在其他植物物种中，也有描述在非腺毛柄表面产生的角质层疣突类似于大麻植物中观察到的疣突，它们的作用通常不明确。在角质层疣突区域，角质层可能更具通透性，但这需要进一步确认。在大鼠盐分积聚的植物表面区域，特别是天然产生大量毛状体的叶脉沿线，观察到了组织坏死。没有大量盐分积聚的区域则无症状。受影响植株恢复并继续正常生长至收获。
某些植物物种应对高盐分生长环境的能力是众所周知的。高盐分水平会通过渗透胁迫、营养失衡和氧化应激对植物生长产生负面影响。这些耐盐植物或盐生植物随后进化出各种机制，以减少盐分对植物组织的潜在毒性。其中，约有370个物种被称为泌盐盐生植物，它们能够从叶或茎分泌盐分，导致在植物组织表面形成可见的盐分沉积。这些植物可能拥有盐囊或盐腺，两者都可以分泌离子，特别是钠和氯，以降低其毒性。分泌盐分的第三种机制存在于禾本科的一些成员中，它们会产生微毛，这也是改良的毛状体，可以分泌盐分，在叶表面形成可见晶体。
虽然大多数植物在叶和茎表面产生大量的毛状体，但只有盐生植物物种具有将盐分沉积到这些结构中并随后将其分泌出细胞的能力。植物分泌盐分能力的差异与其在盐分条件下生长的能力相关。在棉花植物中，被定性为耐盐的基因型与敏感基因型相比，被发现能从叶毛分泌更多的盐离子，并且在叶表面积聚更多的盐晶体。扫描电子显微镜结合X射线微区分析是研究盐腺或盐囊分泌
