一种新型HPLC方法应用于人乳与牛乳中关键乳蛋白的分离与定量研究

《Journal of Food Composition and Analysis》：New HPLC method for the separation and quantitation of individual milk proteins in human breast milk and bovine milk

本研究针对现有方法在分析热处理人乳时易失真的难题，开发了一种快速、可靠的RP-HPLC/UV方法。该方法成功实现了人乳中β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶和人血清白蛋白等6种关键蛋白的同步分离与准确定量，并能同时用于分离牛乳蛋白及其常见遗传变体。研究明确揭示了新HPLC方法相较于凯氏定氮法的优越性，为精确评估乳品营养与安全提供了强有力的分析工具。

　　

母乳，被誉为婴儿最理想的“液体黄金”，其复杂的成分对婴儿的健康成长和长期发育具有深远影响。其中，蛋白质不仅是构建生命的基础营养素，许多乳蛋白还承担着免疫保护、抗菌、促进矿物质吸收等重要生物学功能。然而，人乳的蛋白质组成并非一成不变，它受到母亲饮食、健康状况、哺乳阶段等多种因素的影响。准确解析人乳中各类蛋白质的具体含量，对于评估其营养价值、指导特殊婴儿（如早产儿）喂养、优化婴儿配方奶粉设计至关重要。

传统的乳蛋白分析方法，如凯氏定氮法，虽然能测定总氮或总蛋白含量，但无法区分具体的蛋白质种类。更关键的是，在分析经过巴氏杀菌处理（这是母乳库的标准操作，旨在杀灭病原体）的人乳样品时，热处理会导致乳清蛋白变性并与酪蛋白胶束结合。这使得凯氏定氮法会错误地高估酪蛋白含量，同时低估乳清蛋白含量，从而扭曲了乳清蛋白与酪蛋白的真实比例，而这一比例是评估乳品营养特性的核心指标之一。尽管高效液相色谱（HPLC）等技术在分析牛乳蛋白方面已较为成熟，但能够同时、快速、准确地分离和定量多种关键人乳单个蛋白的标准化方法仍十分缺乏。为此，Sabrina P. Van den Oever和Helmut K. Mayer开展研究，旨在建立一种可同时适用于人乳和牛乳蛋白分析的新型高效分析方法。相关研究成果发表于《Journal of Food Composition and Analysis》。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：首先，研究收集了52份来自西班牙瓦伦西亚母乳库的人乳捐赠样品（其中26份为原料乳，26份经Holder法巴氏杀菌），并使用牛乳样品进行方法开发。其次，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）联用紫外检测法作为核心分析手段，对样品中的目标蛋白进行分离与定量。第三，平行使用凯氏定氮法（依据ISO/IDF标准）测定样品中的总氮、非酪蛋白氮和非蛋白氮，以计算粗蛋白、真蛋白、酪蛋白和乳清蛋白含量，用于方法比对。第四，应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对选定的人乳样品进行蛋白质谱分析，并与牛、羊、山羊、马等其他物种的乳样进行指纹图谱对比。

3.1. 已建立的RP-HPLC-UV方法的性能

研究人员对所开发的RP-HPLC-UV方法进行了全面验证。结果表明，该方法在线性、仪器精密度、重复性精密度、中间精密度以及准确度方面均表现优异。所有6种目标分析物（β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、人血清白蛋白、溶菌酶）的校准曲线线性决定系数（R²）均大于0.99。方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）较低，与同类研究相比具有优势或相当。通过加标回收实验验证的准确度在95%至102%之间，证实了方法的可靠性。

3.2. 人乳样品的总蛋白含量及蛋白质组分

通过凯氏定氮法分析发现，52份人乳样品的平均粗蛋白含量约为1.2克/100克，真蛋白含量约为0.9克/100克。值得注意的是，人乳中的非蛋白氮（NPN）比例较高，平均约占粗蛋白的25%。对于原料乳，凯氏定氮法测得的平均酪蛋白和乳清蛋白含量分别为0.42克/100克和0.48克/100克。然而，在巴氏杀菌乳中，测得的酪蛋白含量异常升高（0.64克/100克），而乳清蛋白含量显著降低（0.25克/100克），这被怀疑是由于热处理导致乳清蛋白变性并与酪蛋白结合，干扰了凯氏法的分离测定。

3.3. 人乳蛋白的RP-HPLC分析

RP-HPLC分析成功分离并定量了人乳中的6种主要蛋白质。结果显示，β-酪蛋白是含量最丰富的酪蛋白，在原料乳和巴氏杀菌乳中的平均浓度分别为2204毫克/升和1960毫克/升；κ-酪蛋白含量很低。在乳清蛋白中，α-乳白蛋白含量最高，其次为乳铁蛋白。人血清白蛋白和溶菌酶也被定量。研究通过对比凯氏定氮法和HPLC法测得的乳清蛋白相对比例，清晰地揭示了两种方法在分析热处理乳样时的关键差异：HPLC分析在原料乳和巴氏杀菌乳之间未显示出显著差异，因为其使用的还原性样品缓冲液能完全溶解酪蛋白并变性乳清蛋白，从而获得准确结果；而凯氏法则错误地指示巴氏杀菌乳中酪蛋白值升高、乳清蛋白值降低。HPLC色谱图直观展示了不同人乳样品在单个蛋白浓度上的明显差异。此外，该方法同样适用于牛乳蛋白分析，能清晰分离包括α_S1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白在内的主要蛋白组分及其常见遗传变体（如κ-酪蛋白A/B型、β-酪蛋白A1/A2/B型）。

3.4. SDS-PAGE

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析提供了人乳与其他物种（牛、绵羊、山羊、马）乳蛋白的指纹图谱对比。结果显示，反刍动物乳以酪蛋白（主要是α_s-酪蛋白和β-酪蛋白）为主，并含有牛乳中含量丰富的β-乳球蛋白；而人乳中β-乳球蛋白完全缺失，主要酪蛋白是β-酪蛋白，且乳清蛋白与酪蛋白的比例不固定，在哺乳不同阶段变化很大。电泳图谱也直观显示了不同捐赠者人乳样品中单个乳清蛋白（如α-乳白蛋白、乳铁蛋白）含量的巨大差异。

本研究成功开发并验证了一种快速、可靠的反相高效液相色谱-紫外检测法，用于同时分离和定量人乳中的六种关键单个蛋白质：β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶和人血清白蛋白。该方法首次实现了使用同一套色谱系统对人和牛乳的单个蛋白质（包括牛乳蛋白的常见遗传变体）进行有效分离。

研究的核心结论在于明确揭示了新型HPLC方法相对于传统凯氏定氮法的显著方法学优势。特别是在分析经过巴氏杀菌的热处理乳样时，凯氏法因乳清蛋白变性结合而严重扭曲了酪蛋白与乳清蛋白的真实比例，而本研究建立的HPLC方法得益于其还原性样品前处理缓冲液（含盐酸胍和二硫苏糖醇），能完全溶解酪蛋白胶束并变性乳清蛋白，从而克服了这一缺陷，获得了准确、不受热处理干扰的定量结果。这为解决长期困扰乳品分析，特别是母乳库质量控制和研究领域中热处理样品蛋白组分准确定量的难题，提供了强有力的技术方案。

此外，研究通过SDS-PAGE证实了该技术可作为快速、可靠的蛋白质指纹图谱工具，用于不同物种乳蛋白以及个体间差异的筛查。研究测得的人乳单个蛋白浓度范围与已有文献报道基本吻合，同时发现不同捐赠者及不同哺乳阶段样品间存在显著差异，这凸显了人乳蛋白质组成的动态性和个体性。

综上所述，该研究不仅提供了一种高精度、高通量的乳蛋白分析新工具，其结论也对精确评估人乳的营养价值、指导婴幼儿配方食品开发、优化母乳库的质控流程以及开展相关的比较营养学研究具有重要的理论和实践意义。