星形胶质细胞TIA1介导的应激颗粒通过隔离胆固醇合成基因mRNA促进实验性自身免疫性脑脊髓炎模型视神经炎脱髓鞘

本研究揭示了星形胶质细胞中T细胞胞内抗原1（TIA1）介导的应激颗粒（SGs）在多发性硬化（MS）视神经炎（ON）脱髓鞘中的新机制。研究发现，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中，星形胶质细胞TIA1表达上调，促进SGs形成并隔离胆固醇合成关键基因（如hmgcs1）的mRNA，导致胆固醇合成减少，从而加剧视神经脱髓鞘。靶向干预此通路（如使用ERβ配体DPN）可部分恢复髓鞘，为治疗MS-ON提供了新的潜在靶点。

　　

1 引言

多发性硬化（MS）是一种中枢神经系统（CNS）的慢性炎症性脱髓鞘疾病，视神经炎（ON）是其常见临床症状，约70%的患者在病程中会经历，表现为亚急性视力损伤等症状，目前缺乏针对ON所致永久性视力损伤的有效疗法。研究表明，应激颗粒（SGs）在神经退行性疾病发病中起关键作用，MS患者脑中SGs相关基因表达增加，且在病变星形胶质细胞中检测到SGs形成。SGs是细胞质内无膜结构的RNA颗粒，包含翻译停滞的mRNA及相关RNA结合蛋白。T细胞胞内抗原1（TIA1）是SGs的关键组分，在应激下于胞质中积累并驱动SGs组装。在MS患者脑中，TIA1从神经元胞核转位至胞质并形成SGs。然而，TIA1介导的SGs在MS-ON中的作用和机制尚不清楚。

2 材料与方法

研究使用Tia1^f/f小鼠与Nestin-Cre或GFAP-Cre转基因小鼠交配，分别构建了中枢神经系统特异性（Tia1^Nestin-CKO）和星形胶质细胞特异性（Tia1^GFAP-CKO）条件性敲除小鼠。通过给雌性小鼠皮下注射MOG_35-55肽和百日咳毒素建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型。采用苏木精-伊红（HE）染色、卢克索尔固蓝（LFB）染色、免疫组化、蛋白质印迹、透射电镜、RNA测序、荧光原位杂交（FISH）、RNA免疫共沉淀（RIP）等技术分析视神经和视网膜的病理变化、基因表达及分子互作。

3 结果

3.1 TIA1在EAE小鼠视网膜神经元和视神经星形胶质细胞中表达上调

在EAE小鼠中，成功建立视神经炎模型，视神经出现明显的脱髓鞘以及小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。免疫染色显示，TIA1及其SGs标志物G3BP1在EAE小鼠的视网膜NeuN⁺神经元和视神经GFAP⁺星形胶质细胞中表达显著上调。

3.2 Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠视神经脱髓鞘得到缓解

中枢特异性敲除Tia1不影响小鼠视神经和视网膜的正常发育。在诱导EAE后，与Tia1^f/fEAE小鼠相比，Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠的体重下降更轻，发病延迟，临床评分显著降低。LFB染色和髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫染色显示，Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠视神经的脱髓鞘评分显著降低，MBP强度显著增加，神经丝重链多肽（NF）强度也相应增加，表明脱髓鞘得到缓解。Nestin-CKO EAE小鼠视神经脱髓鞘得到缓解。">

3.3 Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠视神经炎症浸润减轻

HE染色显示，Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠视神经的炎症细胞浸润明显减少。CD45⁺T细胞密度降低。同时，GFAP⁺星形胶质细胞和Iba1⁺小胶质细胞的活化（肥大形态）受到抑制，其细胞密度也降低。磷酸化组蛋白H3（PH3）染色表明，星形胶质细胞（而非小胶质细胞）的增殖在Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠中减少。Nestin-CKO EAE小鼠视神经炎症浸润减轻。">

3.4 Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠视网膜RGCs丢失和炎症浸润减轻

在视网膜中，Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠的Iba1⁺小胶质细胞密度以及GFAP⁺或波形蛋白（vimentin）⁺星形胶质细胞强度均显著降低。尼氏染色显示，视网膜神经节细胞（RGCs）的丢失被显著抑制。RBPMS⁺或NeuN⁺RGCs的丢失也显著减少。表明中枢Tia1敲除缓解了视网膜炎症浸润，从而减少了RGCs的丢失。Nestin-CKO EAE小鼠视网膜RGCs丢失和炎症浸润减轻。">

3.5 胆固醇合成通路基因在Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠中上调

为探究机制，对视神经进行RNA测序。结果显示，胆固醇合成通路基因，如HMGCS1、LSS、SQLE、FDFT1等在Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠中显著上调。qRT-PCR进一步证实了HMGCS1、HMGCR、LDLR、FDPS等基因mRNA水平的上调。免疫染色显示，HMGCS1蛋白在Tia1^Nestin-CKO EAE小鼠视神经星形胶质细胞中表达明显上调。提示这些基因的mRNA可能被选择性隔离进TIA1介导的SGs中。Nestin-CKO EAE小鼠中上调。">

3.6 Tia1^GFAP-CKO EAE小鼠视神经脱髓鞘和炎症浸润缓解

为进一步研究星形胶质细胞TIA1的作用，构建了星形胶质细胞特异性敲除小鼠（Tia1^GFAP-CKO）。在EAE模型中，Tia1^GFAP-CKO小鼠表现出更好的临床评分。LFB染色、MBP和NF免疫染色均显示其视神经脱髓鞘显著减轻。透射电镜进一步证实，Tia1^GFAP-CKO EAE小鼠的G-比值和髓鞘化轴突百分比下降得到抑制。HE染色显示炎症浸润减轻，CD45⁺T细胞减少，星形胶质细胞和小胶质细胞活化被抑制。GFAP-CKO EAE小鼠视神经脱髓鞘缓解。">GFAP-CKO EAE小鼠视神经炎症浸润缓解。">

3.7 胆固醇合成通路基因在Tia1^-/-星形胶质细胞中因mRNA被隔离减少而上调

在Tia1^GFAP-CKO EAE小鼠中，HMGCS1在视神经星形胶质细胞中表达上调。体外用亚砷酸钠（NaAsO₂）刺激星形胶质细胞构建应激模型。NaAsO₂处理增加了TIA1和G3BP1表达，但降低了HMGCS1表达。而在Tia1^-/-星形胶质细胞中，SGs形成显著减少，HMGCS1的降低被抑制。RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实TIA1蛋白与hmgcs1mRNA结合。荧光原位杂交（FISH）显示，在NaAsO₂处理的Tia1^+/+星形胶质细胞中，hmgcs1mRNA与SGs标志物G3BP1部分共定位，而这种共定位在Tia1^-/-细胞中显著减少。表明胆固醇合成通路蛋白HMGCS1的上调是由于其mRNA被隔离进SGs减少所致。-/-星形胶质细胞中因mRNA被隔离减少而上调。">

3.8 上调胆固醇合成通路促进HMGCS1表达并部分恢复Tia1^GFAP-CKO EAE小鼠的脱髓鞘缺陷

使用雌激素受体β（ERβ）配体二芳基丙腈（DPN）处理Tia1^GFAP-CKO EAE小鼠，以通过上调胆固醇合成来缓解脱髓鞘。DPN处理改善了小鼠的功能恢复。免疫染色显示，DPN处理部分恢复了Tia1^GFAP-CKO EAE小鼠视神经中HMGCS1、MBP和NF表达的降低。表明上调HMGCS1可部分恢复脱髓鞘缺陷。GFAP-CKO EAE小鼠的脱髓鞘缺陷。">

4 讨论

本研究阐明了TIA1介导的SGs在EAE-ON中的作用机制。在EAE小鼠中，星形胶质细胞TIA1介导的SGs增加，通过将其mRNA隔离进SGs，导致胆固醇合成基因（如HMGCS1）下调，从而加剧视神经脱髓鞘。本研究揭示了TIA1介导的SGs在MS-ON中的一个未被认识的功能，即星形胶质细胞TIA1介导的SGs通过隔离胆固醇合成基因的mRNA促进ON的脱髓鞘。这与先前关于MS和EAE模型中SGs增加的研究一致。在病理条件下，持续的SGs可能导致细胞存活率下降。本研究表明Tia1敲除抑制了EAE后的脱髓鞘和炎症浸润。胆固醇合成代谢在脱髓鞘和髓鞘再生中起关键作用，成年后大脑中胆固醇主要由星形胶质细胞合成。本研究证实，在EAE中，星形胶质细胞胆固醇合成基因表达减少，且hmgcs1mRNA被TIA1直接结合并可能隔离于SGs中，这为理解脱髓鞘机制提供了新视角。虽然使用的体外急性应激模型与体内慢性EAE模型存在差异，但本研究结果为未来探索通过减少SGs形成或增加HMGCS1表达来促进髓鞘再生和治疗MS-ON等脱髓鞘疾病提供了新思路。