可持续磷酸化纤维素纳米晶体：一种用于高效富集完整糖肽与磷酸肽的双亲和平台

《Advanced Science》：Sustainable Phosphorylated Cellulose Nanocrystals: A Dual-Affinity Platform for High-Efficiency Enrichment of Intact Glycopeptides and Phosphopeptides

本文报道了一种通过一步磷酸水解绿色合成磷酸化纤维素纳米晶体（P-CNCs）的新策略。该材料可利用表面丰富的羟基，基于亲水作用色谱（HILIC）捕获糖肽；其固有磷酸基团能直接螯合Ti4+离子（P-CNCs-Ti4+）用于磷酸肽富集，无需化学衍生。研究表明，该平台能从微量人血清中高效鉴定N-糖基化和O-GalNAc糖肽，并在小鼠肝脏中深度分析磷酸化修饰，性能优于商业材料。其综合生命周期评估展现了显著的环境可持续性和成本优势，为糖蛋白组学与磷酸化蛋白组学研究提供了高效、绿色、经济的多功能分析平台。

　　

引言

蛋白质的翻译后修饰是调控蛋白质折叠、定位、周转与功能的关键细胞机制。其中，蛋白质糖基化与磷酸化是最重要的两种修饰，深刻影响着众多生物学过程与疾病发生。尽管质谱分析技术已大规模应用于蛋白质与多肽研究，但由于非修饰肽段的高丰度与修饰肽段的低电离效率，在质谱分析前对磷酸肽和糖肽进行有效富集仍是必要步骤。传统的富集材料制备过程通常繁琐、昂贵且不环保。因此，开发一种高效、绿色且可持续的新型富集平台，对于推动糖蛋白组学与磷酸化蛋白组学的发展至关重要。

结果与讨论

P-CNCs与P-CNCs-Ti⁴⁺的制备与表征

本研究通过一步磷酸水解微晶纤维素，简易合成了磷酸化纤维素纳米晶体。所得的P-CNCs材料表面富含羟基和磷酸基团。其丰富的羟基赋予材料优异的亲水性，适用于基于亲水作用色谱模式的糖肽捕获；而引入的磷酸基团则可作为直接螯合位点，与Ti⁴⁺离子结合形成P-CNCs-Ti⁴⁺，用于磷酸肽的富集，无需额外的化学衍生步骤。4+ chelation yields P-CNCs-Ti⁴⁺for selective phosphopeptide enrichment via IMAC.">

透射电镜表征显示，P-CNCs及其Ti⁴⁺螯合产物均呈现良好分散的短棒状形貌，平均长度约423纳米，直径约10纳米，Ti⁴⁺的配位未引起结构聚集。X射线衍射分析证实了材料的水解后结晶性，P-CNCs的结晶度高于原料微晶纤维素。X射线光电子能谱证实了P-CNCs-Ti⁴⁺中C、O、P、Ti元素的存在，高分辨率谱图显示了P-O/P=O和Ti⁴⁺/Ti-O的特征峰。Zeta电位测量显示，从P-CNCs的-11.56 mV到P-CNCs-Ti⁴⁺的+1.96 mV的显著偏移，成功证实了Ti⁴⁺离子的螯合。4+. Transmission electron microscopy (TEM) images of P-CNCs (a) and P-CNCs-Ti⁴⁺(b); The size distribution histograms of P-CNCs showing length (c) and diameter (d); (e) X-ray diffraction (XRD) patterns of P-CNCs before and after Ti⁴⁺coordination; (f) Corresponding crystallinity indices; High-resolution X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectra of P-CNCs-Ti⁴⁺showing the P 2p (g) and Ti 2p (h) regions; (i) Zeta potential measurements of P-CNCs (left) and P-CNCs-Ti⁴⁺(right).">

P-CNCs与P-CNCs-Ti⁴⁺对完整糖肽与磷酸肽选择性富集性能评估

研究人员首先评估了P-CNCs对完整糖肽的富集能力。以人免疫球蛋白G的胰蛋白酶消化物为模型，通过系统优化，确定了最佳富集条件。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析表明，富集前非糖肽信号占主导，而经P-CNCs富集后，完整糖肽的峰清晰可见，几乎无非糖肽信号干扰。

相应地，研究人员评估了P-CNCs-Ti⁴⁺对磷酸肽的富集条件。以β-酪蛋白的胰蛋白酶消化物为模型，MALDI-TOF MS分析显示，直接分析仅能检测到一条单磷酸化肽段，而经P-CNCs-Ti⁴⁺富集后，所有三条磷酸肽（包括两条多磷酸化肽段）均被清晰检出。这些结果表明P-CNCs和P-CNCs-Ti⁴⁺能分别有效富集完整糖肽和磷酸肽。4+. (a) Direct analysis of IgG tryptic digest and (b) analysis after enrichment with P-CNCs; (c) direct analysis of β-casein tryptic digest and (d) analysis after enrichment with P-CNCs-Ti⁴⁺; (*, N-linked intact glycopeptide; ●, phosphopeptides; #, de-phosphopeptides).">

基于P-CNCs的人血清N-连接糖蛋白组深度分析

基于其高特异性，P-CNCs被进一步应用于人血清中完整N-连接糖肽的富集与鉴定。结果显示，仅使用1微升血清胰蛋白酶消化物，在三次技术重复中，P-CNCs材料共计鉴定到2025条独特的N-连接糖肽，对应于126个蛋白质上的264个N-糖基化位点，重现性良好。与基于麦芽糖的富集方法相比，P-CNCs使鉴定到的糖肽数量增加了40%以上，并具有互补性。P-CNCs富集的糖肽显示出更低的等电点趋势，这归因于P-CNCs兼具的亲水性和弱负表面电荷。对鉴定结果的分析揭示了蛋白质N-糖基化的异质性：约50%的糖蛋白仅有一个糖基化位点，而约50%的单个糖基化位点被超过五种不同的聚糖形式修饰。此外，约90%的鉴定糖肽为复合/杂合型聚糖，少于5%为高甘露糖结构。有趣的是，研究还发现了179条带有未知聚糖修饰（大部分质量偏移为+231.09 Da）的完整糖肽，该修饰主要附着在高甘露糖型聚糖上。

为阐明P-CNCs富集N-糖肽的分子机制，研究进行了全原子分子动力学模拟。模拟显示P-CNCs与N-糖肽之间存在有利的相互作用。轨迹分析表明糖肽与P-CNCs的相互作用在大约60纳秒内接近稳定状态。能量分解进一步揭示库仑相互作用主导了吸引力，其主要来源于材料表面磷酸基团和羟基产生的协同氢键网络和静电场。相比之下，范德华相互作用源于最佳的空间匹配。进一步比较三种代表性N-聚糖类型（包括寡甘露糖型、复合型和杂合型）的结合亲和力，模拟显示寡甘露糖型糖肽的相互作用更强，这与实验中复合/杂合型聚糖占主导而寡甘露糖型占比低的情况看似存在差异，推测可能源于实际血清样本中寡甘露糖型聚糖的低丰度。

基于P-CNCs的O-糖蛋白组深度分析揭示位点特异性岩藻糖基化模式

O-GalNAc糖基化是另一种重要的蛋白质糖基化类型。利用P-CNCs材料成功富集N-糖肽的经验，研究人员进一步将其用于富集通常糖链更短、亲水性更弱的O-GalNAc糖肽。为避免N-糖基化干扰，人血清样品在用胰蛋白酶消化前先用PNGase F处理以去除N-聚糖。

结果显示，仅使用1微升血清消化物，在三次技术重复中，共计鉴定到2183条O-GalNAc糖肽。聚糖组成分析显示，O-聚糖主要由(Hex)₁(HexNAc)₁(Neu5Ac)₁, (Hex)₁(HexNAc)₁, 和(Hex)₂(HexNAc)₂(Neu5Ac)₂组成，占总糖肽群的约50%。与N-糖基化中核心岩藻糖基化被广泛研究不同，O-GalNAc聚糖在完整糖肽水平上的位点特异性岩藻糖基化仍鲜有表征。本研究鉴定到128条岩藻糖基化糖肽，对应于40个蛋白质的117条独特肽序列，岩藻糖基化占有率可变。在介导抗原清除的免疫球蛋白重链恒定区α1上观察到了相对较高的岩藻糖基化占有率。岩藻糖基化也在载脂蛋白C-III上被检测到，该蛋白的Thr94是一个已知的O-GalNAc位点，在此位点鉴定到六种不同的聚糖组成，其中三种是岩藻糖基化的。在IGHA1和ApoC-III等特定蛋白质上观察到的优先岩藻糖基化，提示了O-GalNAc岩藻糖基化的潜在功能相关性。