《Advanced Science》：Endometrial Epithelial Lactate Deficiency Drives CD8+ T-Cells Dysregulation in Unexplained Recurrent Implantation Failure
编辑推荐：
本文深入探讨了不明原因反复种植失败（uRIF）的病理机制，通过单细胞RNA测序发现患者子宫内膜中细胞毒性CD8+T细胞异常增殖活化，而腺上皮细胞糖酵解异常、乳酸生成减少。研究揭示了子宫内膜乳酸代谢与免疫耐受失衡之间的新联系，为uRIF的诊断和治疗提供了新靶点。
引言
辅助生殖技术（ART）显著提高了生育率，但许多夫妇即使在经历多个治疗周期后仍难以受孕。反复种植失败（RIF）是一个主要的临床挑战，其常见定义为在40岁以下女性中，至少经历了3个新鲜或冷冻周期，移植了至少4个优质胚胎后仍未获得临床妊娠。约三分之二的种植失败可归因于子宫内膜因素。然而，不明原因RIF（uRIF）是一个特别具有挑战性的亚组，其缺乏明确的病理特征，治疗难度更大。妊娠涉及复杂的过程，其中胚胎植入是初始阶段。最佳的子宫内膜容受性（ER）是成功植入的关键，而在月经周期的分泌中期，子宫内膜达到适合胚胎植入的最佳状态，称为“种植窗”（WOI）。此时，子宫内膜免疫系统转变为免疫耐受状态，以接受半同种异体的胚胎。因此，子宫内膜内的免疫激活会阻碍胚胎植入。代谢调节在子宫容受性中起着重要作用，但早期妊娠期间的代谢机制及其与免疫反应的相互作用尚不完全清楚。在本研究中，我们利用单细胞RNA测序和小鼠模型来研究uRIF的子宫内膜机制。我们的研究结果表明，uRIF患者的子宫内膜存在免疫平衡缺陷，特别是细胞毒性CD8+T细胞的异常增殖和活化，同时腺上皮糖酵解异常和乳酸生成不足，共同导致了胚胎植入失败。
结果
患者队列与单细胞转录组分析揭示uRIF子宫内膜免疫平衡缺陷
我们建立了一个uRIF患者队列，并收集了种植窗期的子宫内膜活检样本进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在质量控制后，共分析了来自11名uRIF患者和10名对照者的179，857个细胞。分析确定了七种主要的细胞类型：成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞和纤毛上皮细胞。值得注意的是，uRIF患者子宫内膜中淋巴细胞的比例增加了近50%，而纤毛上皮细胞的比例减少了约60%。细胞通讯分析显示，在uRIF患者中，与免疫反应相关的信号通路（如IFN-II、IL16、COMPLEMENT）占主导地位，而与子宫内膜容受性相关的通路（如EGF、TWEAK、CSF）在对照组中更突出。
+ T细胞和dNK1细胞在淋巴细胞中的比例对比。">
进一步对淋巴细胞进行分群，鉴定出十个亚群，包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞、三种NK细胞等。其中，CD8+T细胞是最大的亚群，并且在uRIF患者淋巴细胞中的比例显著高于对照组。与经典的细胞毒性功能一致，子宫内膜CD8+T细胞高表达效应基因，如NKG7、GNLY、GZMA和GZMK。基因集富集分析显示，与对照组相比，uRIF患者的CD8+T细胞中细胞毒性相关基因表达更高。通过RT-qPCR和免疫组化验证，uRIF患者子宫内膜中CD8A和IFNG的mRNA表达以及CD8+T细胞的数量均显著增加。此外，利用外部数据集分析发现，在正常月经周期中，淋巴细胞和CD8+T细胞的比例从增殖期到分泌期逐渐下降，并在中分泌期（即种植窗）达到最低点，提示CD8+T细胞比例的生理性下降对建立免疫耐受和成功植入至关重要。
uRIF患者腺上皮表现出分化不成熟和代谢异常
差异表达基因分析显示，在七种细胞类型中，非纤毛上皮（即腺上皮和腔上皮）具有最多的差异表达基因。通过子宫内膜容受性阵列（ERA）基因集评分发现，腺上皮在种植窗期的容受性评分最高。进一步将上皮细胞分为三个亚群：腺1上皮、腺2上皮和腔上皮。基因本体分析表明，腺1上皮富集在“生殖结构发育”、“胚胎植入”和“腺体发育”等相关功能，提示其在胚胎植入中的关键作用。重要的是，uRIF患者腺1上皮的ERA评分低于对照组。
对腺1上皮进行伪时序细胞轨迹分析，发现uRIF患者的细胞更多集中在轨迹早期，而对照组细胞更多分布在轨迹晚期，表明uRIF患者腺1上皮的发育存在延迟。差异表达模块分析显示，uRIF患者的模块以氧化磷酸化和ATP代谢为特征，而对照组的模块则以葡萄糖稳态和葡萄糖代谢为特征，提示uRIF患者腺上皮存在能量代谢异常。
uRIF患者腺上皮糖酵解异常和乳酸生成减少
代谢活性分析显示，在子宫内膜所有细胞类型中，非纤毛上皮的代谢活性最高，其中腺1上皮的代谢活性尤为突出，且uRIF患者的平均代谢评分高于对照组。基因集富集分析和GSVA分析均表明，uRIF患者的腺1上皮在“氧化磷酸化”、“脂肪酸代谢”和“糖酵解”等能量相关通路上富集程度更高。然而，在糖代谢相关基因的表达上，uRIF患者腺1上皮的葡萄糖转运关键基因SLC2A1（GLUT1）以及糖酵解和乳酸生成关键基因ALDOA、LDHA和乳酸转运基因SLC16A3的表达水平均低于对照组。相反，促进乳酸摄取的SLC16A1和促进丙酮酸氧化的LDHB在uRIF组表达更高。这表明在对照组中，糖酵解产生的丙酮酸更多地被转化为乳酸，而在uRIF患者中，丙酮酸更多地进入了氧化磷酸化途径。
通过免疫组化验证，ALDOA和LDHA蛋白主要定位在腺上皮，且在对照组中表达更高。RT-qPCR结果也一致。利用外部数据集和子宫内膜类器官数据分析发现，在正常月经周期中，SLC2A1、ALDOA、LDHA和SLC16A3在腺上皮中的表达在分泌期上调，并在种植窗期达到峰值，且孕激素刺激可显著上调腺上皮中糖酵解和乳酸生成相关基因的表达。体外细胞实验证实，敲低ALDOA会降低子宫内膜上皮细胞系ECC-1的糖酵解速率和糖酵解能力，而过表达ALDOA则产生相反效果。
乳酸不足通过破坏免疫平衡导致植入失败
为了探究乳酸在子宫微环境中是否对植入有益，我们在小鼠模型中进行了一侧子宫角注射乳酸脱氢酶抑制剂oxamate、另一侧注射PBS的对照实验。结果显示，oxamate注射侧的胚胎植入位点数量显著少于对照侧。值得注意的是，通过同时补充外源性乳酸，可以逆转oxamate引起的植入缺陷，表明足够的乳酸生成对于胚胎植入至关重要。
鉴于乳酸在免疫调节中的关键作用，我们假设乳酸对胚胎植入的影响可能是通过影响免疫平衡实现的。细胞通讯分析显示，腺上皮与淋巴细胞，特别是与增殖性T细胞和CD8+T细胞之间的信号交流最为常见，且这种相互作用的强度在uRIF患者中弱于对照组。其中，由腺上皮向淋巴细胞发出的、与免疫调节相关的信号通路（如MIF、COMPLEMENT）在集群分析中成簇，且这些通路已知受缺氧调节并与糖酵解相关。
体外实验进一步验证了乳酸对CD8+T细胞的影响。用ALDOA敲低的ECC-1细胞上清处理初始T细胞，会导致CD8+T细胞和IFNG+CD8+T细胞的比例升高；而过表达ALDOA的细胞上清则产生相反效果。直接使用外源性乳酸钠处理，可显著抑制CD8+T细胞的比例和IFNG的分泌。同样，在oxamate注射的小鼠子宫内膜中，也检测到更多的CD8+T细胞。为了进一步探索IFNG对植入的影响，子宫内注射重组IFNG会显著减少该侧的胚胎植入数量。对已发表胚胎数据集的分析发现，干扰素-γ受体（IFNGR）基因在胚胎各个发育阶段均有表达。这些结果表明，腺上皮乳酸生成不足可能通过破坏CD8+T细胞的免疫平衡，并可能通过其分泌的IFNG影响胚胎，从而导致植入失败。
为了验证CD8+T细胞是否介导了乳酸对植入的影响，我们在小鼠交配前一周使用抗CD8抗体清除CD8+T细胞，然后进行子宫角oxamate/PBS注射实验。在CD8+T细胞被有效清除后，oxamate处理侧与对照侧的胚胎植入数量无差异。然而，在使用抗NK抗体清除NK细胞后，oxamate处理侧的植入数量仍低于对照侧。这表明CD8+T细胞介导了乳酸对胚胎植入的影响。
为了阐明乳酸调节CD8+T细胞增殖和活化的机制，我们对乳酸钠处理不同时间点的T细胞进行了批量RNA测序。差异表达分析发现，乳酸处理组的CD8+T细胞在24和48小时均高表达DUSP1、RGCC、JUN和FOS等基因。其中DUSP1和RGCC分别与细胞凋亡和细胞周期调控相关，其上调解释了乳酸处理下CD8+T细胞增殖减少的原因。此外，乳酸处理组的差异表达基因在“抗原结合”和“DNA包装复合体”通路富集，而在“核糖体生物合成”相关通路富集减少。转录因子活性分析显示，乳酸处理组中调控IFNG表达的转录因子（如STAT2、IRF9）活性较低。总之，乳酸可以抑制CD8+T细胞的增殖和IFNG的分泌，从而有利于建立免疫平衡，促进胚胎植入。
+ T细胞比例的流式分析。(g) 在有无外源性乳酸条件下培养T细胞后，CD8+T细胞及IFNG+细胞比例的流式分析。">
讨论
本研究通过种植窗期子宫内膜的单细胞RNA测序图谱，结合外部数据及体内外实验，阐述了uRIF的潜在发病机制。研究发现，uRIF患者子宫内膜中具有更高比例的CD8+T细胞，并且高表达IFNG。同时，患者子宫内膜的一个腺上皮亚群表现出糖酵解异常和乳酸生成减少。这种乳酸代谢的缺陷破坏了CD8+T细胞的免疫平衡，最终导致植入失败。
一个容受的子宫内膜环境需要对植入的胚胎具有足够的免疫耐受性。在种植窗期，母体子宫内膜转变为免疫耐受状态以保护胚胎。我们的研究揭示了uRIF患者与对照组在种植窗期子宫内膜免疫微环境的显著差异。淋巴细胞，特别是细胞毒性CD8+T细胞比例的增加，提示免疫平衡建立的失败和子宫内膜容受性不良。CD8+T细胞可能通过分泌IFNG等细胞因子，或干扰蜕膜化和血管重塑等间接机制导致植入失败。
同时，我们观察到uRIF患者子宫内膜腺上皮存在糖酵解异常和乳酸生成不足。腺体的正常发育对于妊娠建立至关重要。在子宫内膜所有细胞类型中，腺上皮的代谢最为活跃。与对照组相比，uRIF患者的腺上皮表现出异常的糖酵解和乳酸生成减少，关键基因LDHA和SLC16A3表达降低。在种植窗期，孕激素水平急剧升高，激活MYC和PI3K-AKT等信号通路，进而诱导缺氧诱导因子1（HIF1A）的活化，创造缺氧环境，调节糖酵解相关酶的表达。在缺氧条件下，葡萄糖代谢从氧化磷酸化转变为乳酸生成。然而，uRIF患者腺上皮中ALDOA等基因表达降低，进一步减少了乳酸的产生。
乳酸在调节免疫功能中的作用日益受到关注。我们的研究将子宫内膜葡萄糖代谢改变与免疫平衡联系起来，表明腺上皮中乳酸生成增加可抑制CD8+T细胞的增殖和细胞因子（特别是IFNG）的产生，从而抑制胚胎免疫监视并促进植入。而uRIF患者乳酸生成不足则中断了这一过程。乳酸可能通过诱导组蛋白H3K18乳酸化等翻译后修饰来重塑子宫容受性。
方法
本研究在中国四家医院进行。招募了符合定义的RIF患者以及因男性因素不孕首次进行试管婴儿治疗的对照组女性。在种植窗期（排卵后5天）进行子宫内膜活检取样。样本经过解离制备成单细胞悬液后，使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序文库构建和测序。使用Cell Ranger和Seurat软件包进行数据处理、质量控制和下游分析。通过经典标记基因鉴定细胞类型。使用CellChat进行细胞间相互作用分析，使用scMetabolism进行单细胞代谢活性分析，使用Monocle 3进行细胞分化轨迹推断。通过RT-qPCR、免疫组化、流式细胞术、细胞外酸化率分析以及小鼠子宫角注射模型等进行体内外验证。统计分析使用GraphPad Prism v8进行。
本研究通过调查子宫内膜转录谱，阐述了uRIF的潜在发病机制，提出子宫内膜乳酸不足可能通过损害CD8+T细胞的免疫平衡而导致植入失败，这为uRIF的诊断和治疗提供了新的见解。
