编辑推荐：
长期土壤抗生素抗性基因累积研究揭示猪粪十年施用导致特定ARGs指数增长196%-145%，其丰度与可移动遗传元件协同富集形成持久抗性库。通过高通量qPCR和16S rRNA测序证实，生菜根部ARGs主要源自新鲜粪便输入而非土壤历史累积，且未检测到茎叶污染。该研究为评估有机肥施用风险提供新证据。
双鹏|徐少颖|周北北|华青青|吴攀|林向贵|王一鸣
江苏开放大学环境与生态学院，中国江苏省南京市210036
摘要
全球对有机肥的依赖引发了人们对农业生态系统中抗生素抗性增加的担忧。然而，抗生素抗性基因（ARGs）的长期（十年尺度）动态及其通过即食蔬菜进入食物链的潜在途径仍知之甚少。本研究调查了在两种不同施用强度下，连续10年施用猪粪后土壤中ARGs的积累情况，并评估了这些土壤ARGs和人类致病菌（HPB）向生菜的转移情况。研究结果表明，长期施用粪肥会导致特定“累积型ARGs”在土壤中的线性或指数级积累，其总量在十年间分别增加了196%（施用量为9.0吨/公顷）和145%（施用量为4.5吨/公顷）。这种积累具有剂量依赖性，并与特定细菌宿主和可移动遗传元件的共同富集有关，从而形成了持久的土壤抗性组。虽然生菜根部的ARGs主要来自新施用的粪肥，而非历史上积累的土壤ARGs，但它们在茎和叶部的存在可以忽略不计。值得注意的是，在长期施用粪肥改良的土壤中种植的生菜并未显示出致病菌负荷的增加。总体而言，本研究为理解施用粪肥的稻田土壤中抗生素抗性的演变提供了机制框架，强调了新鲜粪肥输入而非历史积累的土壤ARGs是导致生菜即时抗性风险的主要因素。
引言
抗生素抗性基因（ARGs）是抗生素耐药细菌的根本驱动因素，被视为新兴的环境污染物[1]。目前，在土壤、水和空气等不同环境介质中都发现了大量耐药细菌或基因[2]、[3]。特别是土壤，是ARGs的主要全球储存库[4]。关键的是，土壤中的ARGs可以转移到临床致病菌种群中[5]，并通过水或食物链对人类健康构成威胁[6]。
将牲畜粪肥广泛用作有机肥料虽然有利于提高土壤肥力，但无意中也将ARGs和抗生素耐药细菌引入了农业生态系统[7]、[8]。这些由粪肥带来的污染物不仅增加了土壤中ARGs的多样性和丰度[9]、[10]、[11]，而且随着反复施用可能会持续积累[12]。此外，粪肥施用还促进了粪菌和本土土壤细菌之间的ARGs水平转移，这一过程得益于其中所含的多种可移动遗传元件（MGEs），如广宿主范围质粒和I类整合子[13]。一个关键但尚未解决的问题是，这是否会导致ARGs的长期积累，并最终通过即食蔬菜进入食物链。
目前对于施用粪肥后土壤抗性组长期演变的理解仍然零散且存在矛盾。尽管许多研究表明长期施用粪肥、堆肥粪肥或污泥后ARGs显著富集[10]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]，但也有一些研究观察到ARGs的积累不稳定、停滞甚至下降[19]、[20]、[21]、[22]。这些差异可能源于粪肥类型（例如猪粪与禽粪）、施用频率、土壤类型[23]或土壤性质[24]的不同。更重要的是，大多数证据来自多年施用后的单次时间点比较，仅提供了静态快照，无法捕捉ARGs积累或衰减的动态过程。尽管少数多年研究开始揭示ARGs丰度的逐渐增加[25]、[26]，但这些发现往往受到观察期较短或方法学缺陷（例如使用风干的存档土壤[26]）的限制，导致土壤抗性组的十年尺度轨迹难以量化。
至关重要的是，最终的环境和健康风险不仅取决于土壤中ARGs的积累，还取决于这些历史上积累的ARGs及共存的HPB转移到作物中的可能性。研究表明，施用禽粪或牛粪会显著增加生菜根内生组织、叶内生组织和叶表面的抗生素抗性[27]、[28]。此外，粪肥来源的细菌还会影响蔬菜中的ARGs含量[29]。一些研究表明，有机施肥可以显著提高植物组织中的ARGs水平。例如，施用粪肥的生菜中的ARGs拷贝数比化学施肥的生菜高出八倍[27]，类似地，施用鸡粪后的玉米叶片中ARGs含量增加了四倍[30]。然而，现有证据仍存在矛盾且机制不明确，因为其他研究并未报告施用粪肥后蔬菜组织中ARGs含量的显著增加[31]。大多数现有研究的局限性在于它们主要关注粪肥施用的即时效应，而植物的生长期往往与引入土壤的粪菌衰减阶段重合。关键的是，引入的ARGs往往无法在土壤中稳定存在，富集的本土ARGs可能在几周内恢复到基线水平[32]。这提出了一个基本问题：植物中检测到的ARGs主要来源于新鲜粪肥输入，还是来自历史上积累的持久性土壤抗性组？这一区分对于风险评估至关重要，但目前尚未解决。因此，关于多年或几十年反复施用粪肥后长期积累的土壤ARGs所带来的传播风险，存在明显的知识空白。
基于2006年建立的长期田间实验，本研究旨在解决上述知识空白。我们使用高通量定量PCR（378对引物）系统地分析了连续10年（2010-2020年）施用粪肥后农业土壤中ARGs类型和丰度的年际演变和积累模式。通过盆栽实验结合全长16S rRNA基因测序，进一步评估了土壤ARGs向作物的转移潜力及其相关的HPB污染风险。我们期望这项长期监测工作能为评估基于粪肥的农业生态风险提供新的视角。
实验描述和土壤采样
实验在中国科学院常熟国家农业生态系统观测与研究站（北纬31°33’，东经123°38’）进行。该实验区域的土壤类型通常称为稻田土，中国的土壤系统被归类为Gleyic-Stagnic Anthrosols。该站有两个长期施用粪肥的试验田。试验田1始于2006年，分别施用新鲜（F）或堆肥（C）猪粪，施用量为4.5吨/公顷（L）
长期冷冻储存对土壤样本中ARGs丰度无显著影响
根据我们之前的测量结果[14]，我们选择了和（在不同处理组间存在差异）以及（无显著差异）进行重新测量。目的是观察土壤和DNA样本经过10年冷冻储存后是否会影响初始结果。由于qPCR分析中的随机实验误差（主要是由于质粒浓度变化导致的标准曲线不一致），2023年测量的16S rRNA基因和的数量
结论
本研究阐明了在连续施用猪粪条件下农业土壤中ARGs的十年尺度积累动态，并评估了它们通过即食蔬菜进入食物链的传播潜力。我们的长期数据表明，粪肥施用导致特定累积型ARGs（例如多重耐药性、消毒剂、磺胺类、MLSB、氨基糖苷类、四环素和万古霉素抗性）的线性或指数级富集
环境意义
本研究加深了对施用粪肥的土壤中ARGs十年积累及其通过食物链传播潜力的理解。结果表明，长期施用粪肥会导致特定ARGs和MGEs在农业土壤中的剂量依赖性积累。关键的是，ARGs/MGEs与特定细菌的协同富集形成了持久的土壤抗性组。在施用粪肥6-15年后，积累的土壤ARGs和
作者贡献声明
华青青：研究工作。
吴攀：研究工作。
林向贵：撰写 – 审稿与编辑，监督。
王一鸣：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。
双鹏：撰写 – 审稿与编辑，撰写初稿，验证，方法学研究，研究工作，资金获取，概念构思。
徐少颖：研究工作，数据管理。
周北北：方法学研究，研究工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究部分得到了江苏省自然科学基金（BK20201110）、国家自然科学基金（41501275, 21377137, 20607024）、国家重点技术研发计划（2023YFD1702205）以及江苏省高校“蓝色计划”的支持。
