《Journal of Industrial and Engineering Chemistry》：Enhanced triterpenoid biosynthesis in
Wolfiporia cocos through combined metabolic pathway engineering and fermentation condition optimization
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通过过表达 Wolfiporia cocos 的 farnesyl diphosphate synthase (FDPS) 和 squalene synthase (SQS) 基因增强 MVA 途径，结合玉米油补充和 Box-Behnken 设计优化发酵参数，工程化真菌在 10 L 生物反应器中实现三萜类化合物（WCTs）产量达 53.3 mg/g 和 1252 mg/L，其中 pachymic acid、tumulosic acid 和 2,3-hydroxybetulinic acid 浓度分别为 2.51、52.1 和 21.2 mg/L，体外实验显示对 K562 和 L1210 白血病细胞抑制率超 60%。
陈天鹏|刘静|唐晨敏|于斌|牛焕清|沙宇|孙文军|陈勇|应汉杰
中国南京工业大学生物技术与制药工程学院材料导向化学工程国家重点实验室，南京211816
摘要
Wolfiporia cocos 三萜类化合物（WCTs）是由传统药用和食用真菌Wolfiporia cocos产生的天然生物活性羊毛甾烷型三萜类化合物。在本研究中，我们通过过表达法尼基二磷酸合成酶（FDPS）和角鲨烯合成酶（SQS）基因，将W. cocos改造为真菌细胞工厂，从而增强了甲羟戊酸途径的表达。随后，我们采用Box-Behnken设计结合玉米油补充优化了发酵参数，使三萜类化合物的含量达到42.6 mg/g。此外，在10升生物反应器中的放大生产进一步将WCTs的产量提高到53.3 mg/g和1252 mg/L，其中厚朴酸、木酮酸和2,3-羟基贝塔林酸的浓度分别达到了2.51 mg/L、52.1 mg/L和21.2 mg/L。此外，WCTs表现出剂量依赖性的体外抗肿瘤活性，能够抑制K562和L1210白血病细胞的生长超过60%。总之，这些结果证明了工程化W. cocos的 submerged 发酵是一种生产生物活性三萜类化合物的有效平台，为开发其他药用和食用真菌作为高价值生物活性代谢产物的细胞工厂奠定了基础并提供了实际参考。
引言
棕色腐朽真菌Wolfiporia cocos（同义词Poria cocos）的菌核在东亚地区几个世纪以来一直被用作药材和食用蘑菇[1]。在北美，W. cocos的食用菌核被称为“Tuckahoe”或“Indian bread”[2]。在传统中医框架下，W. cocos是“药食同源”的典型例子，既可作为食物也可作为药物用于预防和治疗疾病[3]。三萜类化合物是生物体内结构最多样化的特殊代谢物之一[4]。W. cocos 三萜类化合物（WCTs）已被确认为W. cocos的主要生物活性成分，具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化作用[5]、[6]。特别是厚朴酸（PA），作为一种羊毛甾烷型三萜类化合物，被认为是W. cocos菌核的主要活性成分，引起了特别关注[2]、[7]、[8]，这表明WCTs是开发功能性食品和新疗法的有吸引力的候选物质。
在自然界中，W. cocos在Pinus属植物的根部形成大型菌核，以松木中的纤维素、半纤维素和木质素为营养来源[9]。然而，菌核的形成严重依赖于环境条件，而商业化栽培需要大量的松木，对森林资源和环境造成了很大压力。先前的研究表明，submerged培养的菌丝体中的三萜类化合物含量远高于菌核[10]。因此，为了克服自然环境和对松木的过度依赖，实现WCTs生产的标准化及其未来的临床应用，submerged 发酵是一种可行的策略，因为它具有优越的时空效率和批次稳定性[11]。这些独特特性为大规模生物合成生物活性三萜类化合物提供了可能性。
目前，合成生物学的快速发展为提高微生物生产天然产物（包括萜类化合物）提供了强大的工具，其基础在于底盘细胞开发、代谢工程和发酵工程[12]、[13]、[14]。食用和药用真菌特别适合作为三萜类化合物生产的底盘，因为它们具有天然的萜类化合物生物合成基因簇、对产物的高耐受性以及多种辅酶系统，如细胞色素P450还原酶（图1A）[15]、[16]、[17]、[18]。因此，利用食用和药用真菌作为萜类化合物生物合成的底盘菌株具有重要意义，这可以为开发生物活性制剂提供更多的先导化合物。通常，通过优化发酵条件[19]、添加外源物质（如植物油、表面活性剂和诱导剂）来诱导萜类化合物的合成[20]，以及调节甲羟戊酸（MVA）途径和下游三萜类分支的关键基因表达[21]，可以增强三萜类化合物的生物合成。W. cocos中PA及相关羊毛甾烷型三萜类化合物的生物合成途径及其相关基因已被阐明[22]，提高了我们对这一物种中三萜类化合物生物合成的理解。然而，关于W. cocos中高效三萜类化合物生产的途径工程和发酵优化的系统整合研究却很少。
在本研究中，我们使用W. cocos作为真菌细胞工厂来生产高价值的三萜类化合物。首先，通过过表达关键的三萜类化合物生物合成基因增强了MVA途径。接下来，系统优化了发酵条件，并筛选了植物油作为外源添加剂以进一步提高submerged培养中的三萜类化合物产量。最后，在10升生物反应器中进行了放大生产；通过HPLC-MS对所得菌丝体的三萜类化合物组成进行了分析，并评估了其对白血病细胞系的体外抗肿瘤活性。总体而言，这项工作为高效生物合成高价值生物活性三萜类化合物提供了参考，并为进一步开发和应用食用和药用真菌作为真菌细胞工厂奠定了基础。
部分内容摘要
菌株和培养条件
Wolfiporia cocos菌株CGMCC 5.78购自中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。固体培养基为PDA，培养温度为26℃。种子培养基含有20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、0.5 g/L KH2PO4和0.03 g/L MgSO42PO4、0.03 g/L MgSO4和0.1 g/L维生素B1，培养条件为25℃和160 rpm，接种量为5%。质粒在
在W. Cocos中过表达FDPS和SQS的功能表征
FDPS是法尼基二磷酸合成酶，而SQS是角鲨烯合成酶。FDPS催化二甲基烯丙基-PP转化为法尼基二磷酸，随后SQS进一步催化生成角鲨烯，这些都是三萜类化合物生物合成的潜在分子靶点和关键酶[25]、[26]。为了探讨FDPS和SQS在调节WCTs生物合成中的作用，我们绘制了MVA途径（图1A），并使用pBluescript SK质粒过表达了FDPS和SQS（图1B）。
结论
在本研究中，通过过表达法尼基二磷酸合成酶和角鲨烯合成酶，将W. cocos改造为真菌细胞工厂，并采用BBD结合玉米油补充优化了发酵条件。在10升生物反应器中，工程化菌株FDPS-2产生的三萜类化合物含量达到53.3 mg/g和1252 mg/L，包括厚朴酸、木酮酸和2,3-羟基贝塔林酸。WCTs表现出剂量依赖性的体外抗肿瘤活性，能够抑制K562和L1210白血病细胞
CRediT作者贡献声明
陈天鹏：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，项目管理，实验研究。刘静：撰写 – 原稿，数据分析。唐晨敏：方法学研究，数据管理。于斌：资源协调。牛焕清：项目管理。沙宇：项目管理。孙文军：资金筹集。陈勇：监督，资金筹集，概念构思。应汉杰：监督，资金筹集，概念构思。
资助
本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFC2105400）、江苏省先进生物制造协同创新中心（XTA2201）、材料导向化学工程国家重点实验室（SKL-MCE-22A04）、江苏省高等教育机构自然科学基金（24KJB530014）、江苏省基础研究计划（BK20233003）、江苏省优秀博士后计划（2024ZB495）等项目的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢武汉理工大学（中国武汉）的吴文军副教授提供pBluescript SK质粒，并指导质粒构建和遗传转化。同时感谢上海OE Biotech有限公司对传统中药组学的分析。
