《Journal of Translational Autoimmunity》：A novel epigenetic regulation of JAM-A by EZH2-DNMT3A cascade contributes to T cell adhesion via the activation of Rap1a in lupus patients
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本研究发现，在系统性红斑狼疮(SLE)患者T细胞中，EZH2/H3K27me3通过抑制DNMT3A表达，降低JAM-A启动子区甲基化水平，从而上调JAM-A表达。激活的JAM-A通过Rap1a/β1整合素信号通路增强T细胞黏附能力，而miR-26a-5p与EZH2形成负反馈调控环路。靶向抑制EZH2可有效缓解小鼠狼疮模型病情，为SLE治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。
系统性红斑狼疮，一种累及全身多器官的自身免疫性疾病，就像一个免疫系统“认友为敌”的混乱战场。其中，活化的炎症性T细胞浸润器官是导致组织损伤的关键步骤，而这个“入侵”过程离不开细胞黏附与迁移分子的帮助。连接黏附分子A，这个通常在上皮细胞紧密连接处维持“边防”的蛋白，被发现可能在T细胞的“越境”行为中扮演着重要角色。同时，科学家们注意到，在SLE患者的T细胞中，存在着广泛的表观遗传调控异常，比如组蛋白修饰和DNA甲基化的改变，这被认为是驱动疾病发生发展的“幕后黑手”。那么，这两者之间是否存在联系？一种名为EZH2的组蛋白甲基转移酶，其异常表达已被发现在多种疾病中起作用，它是否会与JAM-A“联手”，共同导演SLE中T细胞的异常黏附与迁移这场“戏”呢？为了揭开这个谜团，由云南大学崔清华、丁磊等人领导的研究团队开展了深入探索，相关成果发表在《Journal of Translational Autoimmunity》上。
为了回答上述问题，研究人员运用了多种关键技术。他们首先采集了SLE患者和健康志愿者的外周血，分离外周血单个核细胞和T细胞进行后续分析。在细胞模型上，他们使用了EZH2的特异性抑制剂GSK126或小干扰RNA来敲低EZH2或JAM-A的表达，也通过质粒转染过表达JAM-A。通过染色质免疫共沉淀技术分析了H3K27me3和DNMT3A在靶基因启动子区的结合情况，并通过亚硫酸氢盐测序PCR检测了JAM-A启动子区的DNA甲基化水平。细胞黏附能力则通过Boyden小室体外黏附实验进行评估。此外，研究还利用双荧光素酶报告基因实验验证了miR-26a-5p与EZH2、Rap1a的靶向关系，并在MRL/lpr自发性狼疮小鼠模型上进行了in vivo药效评价。
3.1. JAM-A和EZH2在SLE患者PBMCs和T细胞中的表达增加
研究人员发现，与健康供者相比，SLE患者外周血单个核细胞和T细胞中JAM-A和EZH2的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，且两者表达呈正相关。未接受治疗的新发SLE患者（高JAM-A染色组）中JAM-A阳性细胞比例更高，而经临床治疗后（低JAM-A染色组）该比例下降，提示JAM-A和EZH2是与SLE疾病活动性相关的激活因子。
3.2. JAM-A受EZH2修饰的DNMT3A甲基化调控
有意思的是，通常作为转录抑制因子的EZH2，其表达却与JAM-A正相关。机制研究表明，在T细胞或Jurkat细胞中使用GSK126抑制剂或EZH2 siRNA敲低EZH2后，H3K27me3水平下降，而DNA甲基转移酶DNMT3A（而非DNMT1或DNMT3B）的表达反而上调。这导致JAM-A基因启动子区域（-275至+247 bp）的甲基化水平升高，从而抑制了JAM-A的表达。染色质免疫共沉淀实验证实，抑制EZH2后，H3K27me3在DNMT3A启动子近端区域的占据减少，而DNMT3A在JAM-A转录起始区域上游的结合增强。在SLE患者T细胞中，DNMT3A的mRNA表达与EZH2、JAM-A的mRNA表达均呈显著负相关。这些结果揭示了EZH2通过H3K27me3抑制DNMT3A，进而由DNMT3A去甲基化激活JAM-A表达的级联调控机制。
3.3. 抑制EZH2和JAM-A可抑制β1整合素依赖的T细胞对细胞外基质的黏附
SLE的特征之一是T细胞过度活化的黏附和迁移。体外黏附实验表明，SLE患者T细胞的黏附能力高于健康对照。用GSK126或EZH2 siRNA处理T细胞或Jurkat细胞，其黏附能力显著降低。使用中和抗体J10.4阻断JAM-A的同源二聚化，同样能减少细胞对基质包被滤膜的黏附。机制上，在Jurkat细胞中过表达JAM-A可上调Rap1a和β1整合素的表达并增强细胞黏附；反之，敲低JAM-A则产生相反效果。这证明JAM-A通过调节Rap1a/β1整合素信号通路来调控T细胞的黏附能力。
3.4. EZH2与miR-26a-5p之间的负反馈环路
研究进一步发现了微观层面的精细调控。通过生物信息学预测和验证，他们确定miR-26a-5p可以直接靶向EZH2。在T细胞和Jurkat细胞中转染miR-26a-5p模拟物，可下调EZH2和H3K27me3的表达。反过来，抑制EZH2的表达（用GSK126或siRNA）则会上调miR-26a-5p的水平。染色质免疫共沉淀实验显示，抑制EZH2后，H3K27me3在miR-26a-5p宿主基因CTDSPL和CTDSP2启动子区域的富集减少。这表明miR-26a-5p直接靶向EZH2，而miR-26a-5p自身又受到EZH2介导的H3K27组蛋白三甲基化的表观遗传抑制，从而形成了一个负反馈调节环路。此外，研究还发现miR-26a-5p也能靶向Rap1a，从而在多个层面参与调控。
3.5. 用GSK126抑制EZH2可改善MRL/lpr小鼠的狼疮样疾病表型
为了验证靶向EZH2的治疗潜力，研究在MRL/lpr自发性狼疮小鼠模型中使用了EZH2高选择性抑制剂GSK126。结果显示，GSK126治疗能显著提高小鼠存活率，降低血浆中抗双链DNA抗体滴度，减少脾脏中白细胞介素-10和转化生长因子-β的表达，并减轻肾脏肾小球的病理损伤。免疫组化显示，小鼠肾脏中JAM-A和β1整合素的表达也明显降低。蛋白印迹分析证实，GSK126治疗降低了脾细胞中EZH2、H3K27me3、JAM-A、Rap1a和β1整合素的表达，同时升高了DNMT3A的表达。这些体内实验结果表明，抑制EZH2能够有效缓解狼疮样疾病的进展。
综合以上研究结果，本文得出结论：在SLE患者T细胞中，EZH2表达上调，通过催化产生H3K27me3抑制了DNMT3A的表达，进而导致JAM-A启动子区低甲基化和其表达升高。高表达的JAM-A通过激活Rap1a/β1整合素信号通路，增强了T细胞的黏附能力。与此同时，EZH2与miR-26a-5p之间形成了一个负反馈调控环路，并且miR-26a-5p也靶向抑制Rap1a，构成了一个复杂的调控网络。最终，这共同导致了T细胞过度黏附和迁移，参与SLE的发病过程。
这项研究的意义重大。首先，它首次系统地阐明了EZH2通过表观遗传级联（EZH2/H3K27me3 → DNMT3A → JAM-A）调控T细胞黏附分子表达的新机制，为理解SLE的免疫病理机制提供了新的视角。其次，研究揭示了EZH2、miR-26a-5p、JAM-A和Rap1a之间构成的复杂调控网络，展现了疾病中多层面调控的交互作用。最重要的是，研究通过体内外实验证明，靶向抑制EZH2（使用GSK126）能够有效逆转上述异常调控，并缓解狼疮模型小鼠的疾病症状，这为SLE的治疗提供了一个极具潜力的新靶点。JAM-A和EZH2有可能成为SLE疾病活动性的诊断生物标志物，而针对EZH2-JAM-A轴的干预策略，例如使用EZH2抑制剂，有望发展为未来SLE治疗的新方法。
