《LWT》：Development of a novel phage cocktail and its efficacy in controlling carbapenem-resistant
Klebsiella pneumoniae in the food production chain
编辑推荐：
面对食源性致病菌污染日益严峻的挑战，本研究聚焦于分离、表征并应用针对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的噬菌体。研究人员成功开发了一种由LAL003和YP11噬菌体组成的鸡尾酒疗法，该疗法具有广谱、安全、高效的特点，能在猪肉、牛奶、生菜等多种食品基质及聚丙烯、不锈钢等常见食品接触表面上有效杀灭CRKP并清除其生物膜。该研究为应对CRKP沿食品生产链的传播与交叉污染提供了创新的生物防控策略，具有重要的公共卫生与食品安全意义。
在当今的餐桌上，我们享受着来自全球各地的丰富食材，但伴随美味而来的，还有潜藏的食物安全风险。其中，一类名为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae）的细菌，正悄然成为食品供应链中的不速之客。更令人担忧的是，其中一部分细菌进化出了抵抗最强力抗生素之一——碳青霉烯类抗生素的能力，被称为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）。这些“超级细菌”不仅能在肉类、奶制品、蔬菜中被检出，还能在厨房的砧板、水槽乃至食品加工设备表面形成顽固的生物膜，成为反复污染食品的“细菌堡垒”。传统的化学消毒和热处理手段往往难以平衡有效杀菌与保持食品品质之间的关系，有时还可能引发细菌耐药性。因此，寻找一种既能精准打击有害细菌，又对环境和食品本身友好的新型“生物武器”，成为了保障“舌尖上的安全”的迫切需求。近期，一项发表在食品科学领域权威期刊《LWT》上的研究，为我们带来了一种充满希望的解决方案：一种新型的噬菌体鸡尾酒。
噬菌体（Bacteriophage），顾名思义是“吃”细菌的病毒。它们像大自然中的精准“猎手”，能够特异性地感染并裂解特定的细菌，而对人体细胞和食物中的有益菌群“秋毫无犯”。将几种具有不同“猎杀”能力的噬菌体混合成“鸡尾酒”，可以拓宽攻击范围，并延缓细菌产生抗性，是当前抗菌研究的热点。为了应对食源性CRKP的威胁，来自黑龙江八一农垦大学的研究团队开展了一项系统研究，旨在开发一种安全、高效、适用于整个食品生产链的噬菌体鸡尾酒防控策略。
研究人员首先从中国大庆的污水样本中，以标准菌株K. pneumoniae ATCC 700603为宿主，分离并纯化出了两株全新的噬菌体，分别命名为LAL003和vB_KpnM-YP11（YP11）。他们随后对这两株噬菌体进行了全面的生物学和基因组学表征，评估了其作为生物防控剂的潜力，并最终将它们组合成鸡尾酒，在模拟的真实食品生产环境中测试了其杀菌和抗生物膜效果。研究结果表明，这种噬菌体鸡尾酒能有效抑制和清除食品及其接触表面上的CRKP，为控制其沿食物链传播提供了强有力的工具。
为完成这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：1. 采用双层琼脂平板法从环境样本中分离、纯化噬菌体，并利用透射电子显微镜（TEM）观察其形态。2. 通过斑点法和生长曲线测定，评估噬菌体的裂解谱、最佳感染复数（MOI）、一步生长曲线（包括潜伏期和裂解量）以及对不同pH、温度、紫外线和乙醇的耐受性。3. 利用全基因组测序（基于Illumina MiSeq平台）和生物信息学分析（如RAST、CARD、VFDB数据库），解析噬菌体LAL003和YP11的基因组特征、分类地位，并筛查毒力因子和抗生素抗性基因。4. 通过大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫模型，注射高滴度噬菌体鸡尾酒，评估其在体内的安全性。5. 建立食品和接触表面污染模型，在猪肉、巴氏杀菌牛奶、生菜以及聚丙烯、不锈钢、硼硅酸盐玻璃、乳胶等材料表面，定量评估噬菌体鸡尾酒在不同温度（4°C和25°C）和不同MOI下对CRKP及其生物膜的杀灭与清除效果。
研究结果：
3.1. 噬菌体LAL003和YP11的形态和生物学特征：透射电镜显示，LAL003和YP11具有多面体衣壳和长尾，属于Straboviridae科的Jiaodavirus属。两者最佳MOI分别为0.01和0.1，潜伏期均为10分钟，裂解量分别为107和185 PFU/感染细胞。
3.2. 噬菌体LAL003和YP11的环境耐受性：两株噬菌体在pH 3-11和4-50°C（LAL003）/60°C（YP11）范围内保持稳定活性。它们对紫外线和乙醇（特别是75%浓度）敏感，提示在实际应用中应避免与这些消毒方式同时使用，但可考虑序贯使用。
3.3. 噬菌体及噬菌体鸡尾酒的裂解活性评估：在液体培养中，相比单一噬菌体，由LAL003和YP11组成的鸡尾酒能更稳定、持久地抑制浮游细菌的生长，延缓了可能出现的抗性菌株增殖。
3.4. 宿主谱和荚膜特性：宿主谱分析显示，YP11能裂解75.76%（50/66）的测试菌株，覆盖10种荚膜血清型；LAL003能裂解54.54%（36/66），覆盖7种血清型。两者均严格特异于肺炎克雷伯菌。基于其互补的宿主谱，将两者制成鸡尾酒后，裂解率提升至87.88%（58/66），覆盖了测试的全部11种荚膜血清型，包括多种CRKP菌株。
3.5. 基因组特征和比较基因组学分析：LAL003和YP11的基因组均为线性双链DNA，大小分别为166,210 bp和166,607 bp，GC含量约39.5%。基因组分析未检测到毒力因子、溶原相关基因或抗生素抗性基因，证实了其遗传安全性。系统发育分析将其归为Jiaodavirus属。比较基因组显示它们与已知的广谱噬菌体ΦKR1和ΦKR8具有高度相似性。
3.6. 基于大蜡螟模型的噬菌体鸡尾酒安全性评估：向大蜡螟幼虫注射高达1010PFU/幼虫的噬菌体鸡尾酒，48小时后所有幼虫均存活，表明该鸡尾酒在实验剂量下无可见毒性。
3.7. 在食品基质中的功效：在4°C和25°C下，噬菌体鸡尾酒在猪肉、巴氏杀菌牛奶和生菜上均能有效抑制CRKP-06菌株的生长。在MOI=10、25°C条件下效果最佳，如在猪肉上12小时减少1.81 lg CFU/mL，在牛奶中9小时减少2.18 lg CFU/mL。研究表明，该鸡尾酒可用于食品加工和储存前的快速污染控制。
3.8. 在食品生产链接触表面的功效：噬菌体鸡尾酒能在4小时内显著减少涂布在聚丙烯、不锈钢、硼硅酸盐玻璃和乳胶表面的CRKP数量。例如，在4°C下，对聚丙烯和不锈钢的减少量分别达到1.51和1.82 lg CFU/mL，在25°C下效果更佳。这证明其可用于食品加工设备和工作台面的快速消毒。
3.9. 在不同材料表面生物膜上的功效：噬菌体鸡尾酒表现出强大的抗生物膜活性。在MOI=10下处理12小时，能清除超过90%的已形成生物膜，对硼硅酸盐玻璃表面的清除率高达99.41%，对聚丙烯、不锈钢和乳胶的清除率也分别达到98.15%、99.23%和92.22%。
研究结论与意义：
本研究成功分离并表征了两株新型、裂解性、遗传安全的肺炎克雷伯菌噬菌体LAL003和YP11。通过理性设计，将两者组合成噬菌体鸡尾酒，实现了对包括11种不同荚膜血清型在内的多种肺炎克雷伯菌（特别是CRKP）的广谱裂解。全面的安全性评估（基因组学分析和体内大蜡螟模型）为其在食品领域的应用奠定了基础。最关键的是，研究系统性地证明了该噬菌体鸡尾酒在模拟真实场景下的双重功效：一方面，它能在猪肉、牛奶、生菜等代表性食品中有效控制CRKP污染；另一方面，它还能高效杀灭附着在聚丙烯、不锈钢、玻璃、乳胶等常见食品接触材料表面的CRKP浮游菌及其形成的顽固生物膜。
这项研究的创新性和重要意义在于，它不仅仅停留在实验室的杀菌效果验证，而是将解决方案延伸至了整个食品生产链的关键环节。它针对的正是食品加工中棘手的交叉污染问题——细菌从原材料到加工设备，再到最终产品的传播路径。该噬菌体鸡尾酒作为一种天然的生物防控剂，具有宿主特异性高、不破坏食品品质、不易引发细菌广泛耐药性、环境友好等优势。其研究成果为开发新型、高效的食品级消毒剂和防腐方案提供了直接的科学依据和技术储备，对于阻断CRKP等“超级细菌”从农场到餐桌的传播链条，降低食源性疾病风险，保障全球食品安全和公共卫生具有重要的现实价值和应用前景。尽管其长期效果和在更复杂食品基质中的应用仍需进一步验证，但本研究无疑为对抗日益严重的抗生素耐药性及食源性病原菌污染开辟了一条充满潜力的新途径。
