《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Imidazole Propionate Induces Kidney Damage by Activating the ROS-NLRP3 Signaling Pathway Through mTOR Inhibition of Autophagy in Renal Tubular Epithelial Cells
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本文揭示了肠道菌群代谢产物咪唑丙酸（ImP）诱导小鼠肾脏损伤的新机制。研究发现，ImP通过特异性激活mTOR信号通路抑制肾小管上皮细胞的自噬，进而诱导活性氧簇（ROS）产生，并激活NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎性小体，最终导致促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）的表达，造成肾脏结构与功能异常。值得注意的是，mTOR抑制剂雷帕霉素（Rap）能够恢复自噬、抑制ROS/NLRP3/IL-1β轴，从而减轻ImP诱导的肾损伤。该研究不仅阐明了ImP的潜在肾毒性，也为靶向肠道菌群代谢物进行肾脏疾病的预防与治疗提供了理论基础。
2.1. 咪唑丙酸对正常小鼠肾功能的影响
为探究咪唑丙酸（ImP）对正常小鼠肾功能的影响，研究将C57BL/6小鼠随机分为三组：ImP处理组、ImP联合雷帕霉素（Rap）干预组和生理盐水对照组（NC）。实验结果显示，与NC组相比，ImP组小鼠体重显著增加，而联合Rap干预后体重显著下降。各组间空腹血糖水平无显著差异。进一步的肾功能评估显示，ImP组小鼠的尿白蛋白/肌酐比值（ACR）水平显著升高，而Rap干预可有效逆转此趋势。组织病理学分析发现，ImP组小鼠出现肾小球基底膜增厚、系膜基质增生伴细胞增殖，以及肾小管肥大和增生等病理改变。这些变化共同损害了肾小球的滤过屏障功能并减少了白蛋白的重吸收，从而导致ACR水平升高。Rap干预显著改善了ImP诱导的肾脏病理损伤并降低了ACR水平。为阐明ImP诱导的肾脏炎症反应，研究者通过免疫组化检测了肾组织中白介素-1β（IL-1β）的表达水平。结果显示，ImP组肾小管中IL-1β的表达显著上调，而Rap干预可有效抑制其表达。此外，血清IL-1β水平的变化趋势与组织表达结果一致。以上结果表明，ImP可引起正常小鼠肾功能损伤并诱导肾小管炎症反应，而Rap可有效缓解这一病理过程。
2.2. 咪唑丙酸和雷帕霉素对体内外肾细胞自噬水平的影响
本研究基于前期研究，用三种浓度的ImP处理人肾小管上皮细胞（HK-2），以探究其对肾细胞增殖的影响。结果显示，ImP在24小时和48小时处理后以浓度依赖性方式显著抑制HK-2细胞增殖。同时，细胞周期调控蛋白——细胞周期蛋白D1（CYCLIN D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）的表达水平随着ImP浓度的增加而逐渐下调。动物实验也证实，ImP显著降低了肾组织中CYCLIN D1和CDK2的表达，而Rap干预则有效逆转了这些蛋白的下调。鉴于mTOR和AMPK通路在维持肾细胞生长、分化、结构完整性和正常肾功能方面的关键作用，研究者首先检测了小鼠肾组织中mTOR信号通路关键分子的表达水平。蛋白质印迹结果显示，与NC组相比，ImP组中磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白的表达显著上调，而磷酸化AMPK（p-AMPK）/AMPK和磷酸化AKT（p-AKT）/AKT的表达水平无显著差异。为验证此结果，在HK-2细胞模型中进行了平行实验。结果显示，ImP干预能够以剂量依赖性方式激活mTOR信号通路，而Rap干预可显著逆转此效应。与动物实验一致，干预后p-AMPK/AMPK和p-AKT/AKT的蛋白表达仍无差异。这些结果表明ImP能够特异性激活mTOR信号通路。
2.3. 咪唑丙酸和雷帕霉素对体内外肾细胞自噬水平的影响
鉴于mTOR在自噬调节中的核心作用，研究者进一步探究了自噬是否参与了ImP介导的肾损伤。微管相关蛋白1轻链3/微管相关蛋白2轻链3（LC3Ⅱ/LC3I）是自噬体的标志物，其表达水平与自噬活性正相关。动物实验结果显示，与NC组相比，ImP组小鼠肾组织中LC3Ⅱ/LC3I蛋白表达显著降低，而p62蛋白水平显著升高。Rap干预显著恢复了LC3Ⅱ/LC3I的表达并降低了p62水平。体外实验显示，ImP以剂量依赖性方式抑制HK-2细胞的自噬活性，此效应可被Rap处理逆转。为验证自噬流的变化，研究者采用了mRFP-GFP-LC3双荧光标记系统，结果表明ImP以剂量依赖性方式显著抑制自噬流，而Rap可恢复自噬。这些发现共同表明，ImP通过激活mTOR信号通路抑制肾细胞自噬。
2.4. 咪唑丙酸和雷帕霉素对体内外肾细胞ROS-NLRP3信号通路的影响
自噬与ROS-NLRP3信号通路之间存在复杂的调控相互作用。为阐明其机制，研究者通过免疫组化评估了小鼠肾脏中NLRP3的表达，使用DCFH-DA荧光探针测量了细胞内ROS水平，并通过蛋白质印迹分析了NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β的蛋白表达。结果表明，与NC组相比，ImP组肾小管中NLRP3表达显著升高，肾组织中NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β蛋白水平显著上调。Rap干预显著降低了NLRP3表达，抑制了ROS的产生，并抑制了裂解的Caspase-1和IL-1β的过表达。在细胞实验中，ImP处理显著增加了HK-2细胞内的ROS水平，并以剂量依赖性方式诱导NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β蛋白表达上调。Rap预处理显著减弱了ROS的产生，并抑制了NLRP3、裂解的Caspase-1和IL-1β蛋白的过度表达。这些数据共同表明，ImP通过激活ROS-NLRP3信号通路诱导肾脏炎症反应，而Rap干预有效缓解了这一过程。
2.5. mRNA测序与分析
随后，研究者收集了小鼠肾组织进行RNA测序。主成分分析图显示三组之间区分明显。火山图显示，持续摄入ImP 3个月导致152个基因上调和24个基因下调。Rap处理导致29个基因上调和264个基因下调。在NC、ImP和ImP+Rap组中总共鉴定出87个重叠基因。为探索这些差异表达基因的功能分类，进行了功能富集分析。在NC和ImP肾脏中，ImP组富集的通路主要与“信号受体活性”和“分子转导活性”相关，而NC组则在“细胞外基质结构成分”和“细胞骨架蛋白结合”方面富集。与ImP组相比，ImP+Rap组在“线粒体蛋白复合物”、“脂肪酸分解代谢过程”和“线粒体翻译”方面富集。京都基因与基因组百科全书通路分析显示，“代谢通路”和“MAPK信号”在NC和ImP肾脏中富集，而ImP+Rap组则在“线粒体自噬”和“近端小管碳酸氢盐重吸收”等通路中富集。
3. 讨论
咪唑化合物在食物中具有显著的生物蓄积性，可能通过摄入后与肠道菌群相互作用介导不良健康结局。本研究的实验发现通过体内外模型证实，ImP暴露主要导致肾小管区室中IL-1β和NLRP3表达的显著上调。ImP处理后，HK-2细胞的增殖和自噬均受到剂量依赖性抑制，同时磷酸化mTOR和p62蛋白水平显著升高，而对p-AMPK/AMPK或p-AKT/AKT表达未检测到实质性影响。值得注意的是，Rap预处理有效逆转了ImP诱导的mTOR过度激活，恢复了p62的积累，并挽救了LC3-II的表达缺陷。这些发现共同表明，ImP通过mTOR介导的肾小管自噬抑制发挥其肾毒性作用。这一机制见解将mTOR通路调控定位为抵消ImP诱导肾损伤的潜在治疗靶点。
4. 材料与方法
本研究使用的化学物质包括ImP和Rap。使用的抗体包括CDK2单克隆抗体、细胞周期蛋白D1单克隆抗体、兔抗人mTOR单克隆抗体、兔抗人p-mTOR单克隆抗体、兔抗人LC3B单克隆抗体、小鼠抗人p62单克隆抗体、兔抗人NLRP3单克隆抗体、兔抗人Caspase-1多克隆抗体和小鼠抗人IL-1β单克隆抗体。其他试剂包括人IL-1β ELISA试剂盒、ROS检测试剂盒、自噬双标记腺病毒。
HK-2细胞系培养于补充了10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中，置于37°C、5% CO2的湿润环境中。
使用雄性C57BL/6J小鼠，随机分为三组：正常组、ImP组和ImP+Rap组。从7周龄开始，每日腹腔注射给药：正常组接受150 μL生理盐水；ImP组接受100 μg ImP；ImP+Rap组同时给予100 μg ImP和3 mg/kg Rap。连续干预12周后，收集尿液样本，之后对小鼠实施安乐死，采集血清和肾组织并储存于-80°C用于后续分析。
