《MycoKeys》：Identification of endophytic
Trichoderma species (Hypocreaceae, Hypocreales) and their application against leaf blight of host
Platycladus orientalis
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针对古侧柏叶枯病（由Alternaria spp.引起）缺乏有效生物防治剂的问题，研究人员从北京古侧柏中分离鉴定出四种内生木霉菌（Trichoderma spp.），包括一个新种T. platycladi。通过平板拮抗试验和温室盆栽试验，证实这些木霉菌株能显著抑制叶枯病原菌（A. alternata和A. cantlous），并对叶枯病具有显著防治效果，其中T. nordicum CGMCC3.28772效果最佳。该研究为古树名木病害的绿色防控提供了重要的菌种资源和理论基础。
侧柏，这种原产于中国的常绿针叶树，不仅生命力顽强、寿命悠长，更因其象征着吉祥与长寿而被广泛种植于宫殿、寺庙和公园等历史文化胜地。北京拥有中国数量最多的古树，其中古侧柏多达22,570株，占全市古树总数的55.69%，堪称“活的文物”。然而，这些历经沧桑的古树，在进入“过熟”阶段后，生理功能和抗逆性下降，加之城市人为干扰，导致病害风险显著增加。在这些病害中，由链格孢属真菌（Alternaria spp.）引起的叶枯病最为常见，可导致叶片和枝条大面积枯死，严重威胁着古侧柏的健康与存活。尽管早在1922年就有相关病害记录，但长期以来，针对该病害的绿色、高效的生物防治剂（Biocontrol Agents）筛选与应用研究尚属空白。
在此背景下，来自北京林业大学等单位的研究人员开展了一项旨在“发掘”古树自身防御潜能的研究。他们猜想，既然病原菌能侵染植物，那么是否也存在一些有益微生物，它们“居住”在健康的植物组织内部（即内生菌），能够帮助宿主抵抗病害呢？如果从古侧柏自身分离出这样的有益菌，它们可能对同源的病原菌具有更强的适应性和抑菌效果。于是，研究团队将目光投向了木霉属（Trichoderma）真菌。木霉是自然界中分布广泛的一类重要真菌，许多种类已被广泛应用于农业，作为生物杀菌剂来防治植物病害，被誉为植物病害生物防治的“明星”菌种。为了填补古侧柏叶枯病生物防治的空白，研究人员从北京的古侧柏中分离内生木霉菌，并评估其对叶枯病的防治潜力，相关成果发表在真菌学期刊《MycoKeys》上。
为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：首先，从北京中山公园、法海寺、劳动人民文化宫的古侧柏健康组织中分离纯化真菌。其次，结合菌落和显微形态特征，以及基于内部转录间隔区（ITS）、翻译延伸因子1-α（tef1-α）和RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基（rpb2）三个基因位点的多基因系统发育分析，对分离到的木霉菌株进行精确鉴定。接着，采用平板对峙培养法，测定代表性木霉菌株对主要叶枯病原菌（Alternaria alternata和A. cantlous）的拮抗作用。最后，通过温室盆栽试验，在一龄侧柏苗上模拟接种，系统评估了不同木霉菌株在不同接种时序下对叶枯病的实际防治效果。
研究结果
Phylogenetic analysis (系统发育分析)
基于ITS、tef1-α和rpb2基因联合数据集的系统发育树显示，分离到的木霉菌株分别归属于三个不同的系统发育分支（Clade）。其中，菌株CGMCC3.28769和CGMCC3.28770在哈茨木霉分支（Harzianum clade）内形成了一个独立的新支；菌株CGMCC3.28773与已知种T. citrinoviride共同位于长枝木霉分支（Longibrachiatum clade）；菌株CGMCC3.28771和CGMCC3.28772则分别与T. obovatum和T. nordicum聚集在深绿木霉分支（Atroviride clade）内。这为后续的物种鉴定提供了分子依据。
Taxonomy (分类学)
通过详尽的形态学比较和上述系统发育分析，研究人员最终明确了四种植物的身份：重新分离到了已知种桔绿木霉（T. citrinoviride），并首次从侧柏上报道了T. nordicum和T. obovatum这两个物种（即新宿主记录）。而菌株CGMCC3.28769和CGMCC3.28770则被确定为一个全新的物种，根据其宿主来源，将其命名为T. platycladi。该新种的形态特征包括金字塔状的分生孢子梗、烧瓶状至钻状的瓶梗、以及球形至倒卵形的分生孢子等。
Plate antagonism test (平板拮抗试验)
对峙培养试验结果显示，四种木霉的代表性菌株对两种主要叶枯病原菌A. alternata和A. cantlous均表现出显著的抑制效果。从接种第二天（针对A. alternata）或第三天（针对A. cantlous）开始，病原菌在木霉存在下的菌落直径增长就受到显著抑制。培养至第五天时，T. platycladi、T. citrinoviride、T. obovatum和T. nordicum对A. alternata的抑制率分别为52.30%、45.39%、53.29%和55.92%，对A. cantlous的抑制率分别为53.95%、50.33%、55.26%和60.53%。其中，T. nordicum CGMCC3.28772的拮抗作用最强，T. citrinoviride CGMCC3.28773的抑制效果相对最弱。
Evaluation of control efficacy (防治效果评估)
温室盆栽防治试验进一步验证了木霉菌的实际生防潜力。试验设置了三种处理：木霉菌在病原菌接种前一天施用（防治效果最佳）、同时施用、以及在病原菌接种后一天施用。结果表明，所有四种木霉菌处理都对叶枯病产生了显著的控制效果。当木霉菌先于病原菌接种时，相对防治效果均超过75%；即使在病原菌接种后才施用木霉菌，相对防治效果也仍能超过50%。在不同菌株的比较中，T. nordicum CGMCC3.28772在相同接种条件下 consistently（一致地）表现出最低的病情指数和最高的相对防治效果，被证明是防治侧柏叶枯病最具潜力的生防菌株。
研究结论与意义
本研究首次系统地从北京古侧柏中分离、鉴定出包括一个新种（T. platycladi）在内的四种内生木霉菌，丰富了侧柏内生真菌的多样性，其中T. nordicum和T. obovatum为首次在该宿主上报道。平板拮抗和温室防效试验均证实，这些内生木霉菌株能有效抑制导致古侧柏叶枯病的主要病原菌（A. alternata和A. cantlous），并对病害具有显著的防治效果，且以T. nordicum CGMCC3.28772的潜力最大。研究还发现，在病原菌入侵前预先施用木霉菌，能获得最佳防治效果，这可能是由于木霉能够快速在叶片定殖并提前建立优势种群，从而抢占生态位，延缓病害发生。
这项研究的成功开展具有多重重要意义。在实践层面，它为解决古侧柏这一重要文化遗产和生态资源的叶枯病难题，提供了具体、高效且环境友好的生物防治候选菌株（特别是T. nordicum CGMCC3.28772），为开发针对古树病害的专用生物农药产品奠定了关键的菌种基础。在科学层面，研究不仅发现并描述了一个木霉属新物种，拓展了该属真菌的物种多样性，也印证了“从宿主自身寻找生防菌”这一策略的有效性。内生菌对其原生宿主具有更强的适应性，作为生防剂可能更具优势。该成果为其他古树及重要林木病害的生物防治研究提供了可借鉴的思路与方法范例，有助于推动林木病害的绿色可持续治理，对于保护生物多样性、传承历史文化景观具有积极的价值。
