《Environmental DNA》：Genomics-Based Approaches to Ant Monitoring in Land Management: Validation of COI Metabarcoding Primers
编辑推荐：
本综述系统验证了用于蚂蚁（蚁科）生物监测的COI元条形码（DNA metabarcoding）特异性引物。研究通过（in silico）、体外（in vitro）和原位（in situ）分层评估框架，首次确认了蚂蚁特异性引物AntF1/AntR1在澳大利亚热带稀树草原环境中，能有效从土壤环境DNA（eDNA）和标本中检测蚂蚁多样性，克服了传统形态学鉴定的局限性，为土地利用管理中的蚂蚁生物监测提供了基因组合学解决方案。
1 引言
生物多样性评估是监测生态系统健康、指导土地管理的基本工具。蚂蚁（膜翅目：蚁科）作为在全球占主导地位的无脊椎动物，是生态系统变化的常用生物指示剂。它们通过参与营养循环、土壤更替、种子传播、植物防御和动物食物网，在生态系统中扮演着关键角色。然而，传统的蚂蚁监测依赖于形态学鉴定，这种方法耗时、容易出错，且日益受到分类学专业知识匮乏的限制。基因组学方法，特别是DNA元条形码技术，有潜力从根本上改变无脊椎动物生物多样性调查的方式。该技术通过对从混合样本（如大量标本或环境样本）中提取的DNA进行短基因区域（如COI、16S）的PCR扩增、高通量测序，并结合参考数据库进行物种分类学鉴定，能够以比形态学方法少得多的时间和精力，同时鉴定多种生物。
但通过元条形码检测到的类群比例受多种因素影响，包括所选标记基因的分类学分辨率、引物的特异性以及引物数量。线粒体COI区域是元条形码研究陆生无脊椎动物最常用的标记，其高变异性有助于在物种水平上进行区分。然而，这种高变异性也使设计真正通用的引物组变得困难，因此需要经过良好验证的引物来克服这一问题。引物结合位点应尽可能与目标物种的模板序列匹配，尤其是在3‘末端，以尽量减少扩增和检测的偏倚。
蚂蚁特异性的元条形码监测方法在eDNA样本中的应用尚未得到验证。尽管已有研究开发了针对蚂蚁的短扩增子COI元条形码引物，但其较短的扩增子长度限制了分类学分辨率。因此，目前仍缺乏经过环境样本评估验证的蚂蚁特异性元条形码引物组。本研究旨在填补这一空白，通过开发和测试蚂蚁特异性COI引物组，并与通用陆生无脊椎动物引物进行比较，评估它们在eDNA样本中检测蚂蚁物种的性能，以期提供一种经过验证的元条形码方法来支持蚂蚁生物监测在土地管理中的广泛应用。
2 材料与方法
本研究遵循推荐的验证指南，采用分层工作流程来选择检测蚂蚁类群性能最佳的引物，涵盖（in silico）、体外（in vitro）和原位（in situ）分析。
2.1 概述
在（in silico）分析阶段，我们评估了14个COI引物组，包括三个新设计的蚂蚁特异性引物（AntF1、AntR1和EPTDr2n_Ant）和17个之前已验证用于陆生节肢动物的通用无脊椎动物引物。在体外（in vitro）阶段，对三个性能最佳的引物组（AntF1/AntR1、fwhF2/EPTDr2n_Ant和fwhF2/fwhR2n）进行了梯度PCR优化，并使用等摩尔DNA输入的模拟群落评估了扩增偏倚。为了模拟环境检测，还将已知拷贝数的合成gBlock和模拟群落样本“掺入”（spike-in）到混合环境样本中。最后，选取两个性能最佳的引物组进行原位（in situ）案例研究，使用从北领地野生动物公园（先前曾进行过蚂蚁调查）采集的土壤样本中提取的eDNA进行分析。
2.2 （in silico）分析
2.2.1 参考数据库构建
从博物馆的馆藏标本中获取了涵盖19个澳大利亚蚂蚁属的COI条形码，并利用CRABS工具补充了公共条形码库（BOLD）的数据。构建了用于模拟群落和案例研究的单独参考数据库，并生成了一个包含蚁科所有已知属的广泛参考集以评估引物的全局扩增成功率。
2.2.2 引物设计与评估
序列经聚类、比对后，使用PrimerMiner工具评估已发表引物，以确定具有良好分类覆盖度的引物。通过比对结果可视化检查跨类群的保守区域，据此设计新的引物，以最大限度地减少错配并提高对目标类群的分辨率。AntF1和AntR1通过修改现有引物（AncientLepF3和fwhF2）得到，EPTDr2n_Ant则从水生大型无脊椎动物反向引物EPTDr2n改进而来。所有引物（包括新设计）均使用PrimerMiner评估其与模板的错配罚分。最终，基于对全局可用蚁科条形码的（in silico）PCR筛选，评估了三个最佳引物对（AntF1/AntR1、fwhF2/EPTDr2n_Ant和fwhF2/fwhR2n）的扩增成功率。
2.3 体外（in vitro）分析
2.3.1 梯度PCR与模拟群落性能
梯度PCR确定了AntF1/AntR1、fwhF2/EPTDr2n_Ant和fwhF2/fwhR2n的最佳退火温度为50°C。使用包含37个澳大利亚蚂蚁属（代表7个亚科）的等摩尔模拟群落评估了引物的扩增偏倚和分类学分辨率。AntF1/AntR1和fwhF2/fwhR2n分别恢复了37个属中的25个（68%）和26个（70%），而fwhF2/EPTDr2n_Ant仅恢复了2个属（0.05%）。各属的测序读长比例偏离了等摩尔预期，显示出特定类群的扩增偏倚。在分类学鉴定方面，fwhF2/fwhR2n在物种水平上表现出更好的鉴定能力。
2.3.2 土壤掺入实验中的错配与环境抑制效应
将具有零错配和3-4个错配的合成gBlock以不同拷贝数掺入混合土壤样本中，以评估引物-模板错配和土壤环境基质对检测的影响。结果发现，即使使用零错配模板，当拷贝数低于约2×103时也难以被检出；而带有3个或更多错配的模板，则需要极高丰度（>1.58×105拷贝）才能在土壤基质中被检测到。这凸显了错配（尤其位于3‘末端时）和环境抑制物对扩增效率的强烈抑制作用。将模拟群落掺入土壤后，所有引物的属水平检出率均下降，表明环境基质存在抑制效应。其中，AntF1/AntR1对土壤环境基质抑制的耐受性优于fwhF2/fwhR2n，而fwhF2/EPTDr2n_Ant表现不佳，不适合进一步的原位测试。
2.4 原位（in situ）eDNA案例研究
从北领地野生动物公园的长期火干扰实验地采集了五个表层土壤样本，并使用AntF1/AntR1和fwhF2/fwhR2n引物对进行eDNA元条形码分析。与之前通过大量陷阱调查在同一地块记录的28个属相比，土壤eDNA检测到15个属。蚂蚁特异性引物对AntF1/AntR1检测到14个属，而fwhF2/fwhR2n检测到7个属。两种方法共享6个属。eDNA还检测到三个在特定样地陷阱调查中未记录的属（Anochetus、Ochetellus和Stigmacros），尽管它们在该研究地点的其他区域已知。这很可能反映了蚂蚁在样地内分布的空间异质性，而非方法性能差异。值得注意的是，eDNA和陷阱捕捉捕获的是不同的生态信息：eDNA指示了采样土壤体积内生物（只要DNA持续存在，无论死活）的存在，而陷阱则测量地表活跃个体的活动密度。
3 结论
蚂蚁是土地管理中广泛使用的生物指示剂，本研究首次提供了专门针对蚂蚁的元条形码引物的靶向验证，为蚂蚁监测的基因组学方法奠定了坚实基础。通过（in silico）、（in vitro）和（in situ）的分层性能评估，研究证实了靶向性引物设计可提高蚁科物种的检测效果。基于综合性能，我们推荐AntF1/AntR1作为在澳大利亚（并可能在全球其他地区）进行蚂蚁生物监测的主要检测方案，适用于土壤eDNA调查和标本元条形码分析；推荐fwhF2/fwhR2n作为标本元条形码分析的备选方案。本研究为将eDNA方法纳入土地管理的蚂蚁生物监测提供了一个经过验证的工具，有助于实现规模化、高通量的蚂蚁群落监测，同时与专家分类学知识形成互补。未来的研究应进一步优化蚂蚁特异性引物，以最大限度地减少结合位点错配和抑制效应，并在评估不同陆地生态系统中蚂蚁群落组合变化的大规模研究中评估这些检测方案的重复性。
