环境细菌Shewanella sp. ANA-3呼吸四硫酸盐过程中同源四硫酸盐还原酶(Ttr)和多硫化物还原酶(Psr)双重作用机制的证明

这篇研究通过构建缺失突变体、代谢表型分析及生化验证，首次明确了环境细菌Shewanella sp. ANA-3利用同源四硫酸盐还原酶(Ttr)和多硫化物还原酶(Psr)两种酶来呼吸四硫酸盐(S4O62?)，首次提供了Psr同源物可催化此反应的证据，并指出八血红素四硫酸盐还原酶(OTR)和硫代硫酸盐脱氢酶(Tsd)不参与此过程。该工作为理解环境中基于Ttr的四硫酸盐呼吸的广泛分布提供了新的分子依据。

　　

引言

希瓦氏菌（Shewanella）是一类代谢能力极为广泛的兼性厌氧细菌，能够定植于多种水生环境，包括受化学污染的生境，这使得该属成为环境污染物修复的有力工具。其能量代谢，特别是对多种无机和有机化合物的转化能力，一直是研究热点。某些希瓦氏菌种已被证明能够利用硫代硫酸盐脱氢酶（Tsd）氧化硫代硫酸盐（S₂O₃^2?），利用亚硫酸盐脱氢酶（SDH）氧化亚硫酸盐（SO₃^2?）。另一些则被证实可以利用同源多硫化物还原酶（Psr）的酶厌氧呼吸多硫化物（S_n^2?）、元素硫（S⁰）和S₂O₃^2?，利用细胞色素亚硫酸盐还原酶（SirA）呼吸SO₃^2?，以及利用钼酶Dms呼吸二甲亚砜（DMSO）。值得注意的是，水生细菌S. oneidensisMR-1已被证明可以呼吸四硫酸盐（S₄O₆^2?），而这一能力长期以来被认为是人类肠道病原体（如肠杆菌科细菌）的特权，因为S₄O₆^2?被认为是肠道炎症的产物，其呼吸能力可为病原体提供竞争优势。然而，环境细菌还原S₄O₆^2?的能力已被报道数十年。尽管在肠道病原体鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）中负责S₄O₆^2?还原的酶——四硫酸盐还原酶（Ttr）已被鉴定和表征，但该酶在包括希瓦氏菌在内的环境细菌中的功能作用仍有待确立。

来自S. oneidensisMR-1的可溶性八血红素四硫酸盐还原酶（OTR）已被证明能在体外还原S₄O₆^2?，并被提议为体内S₄O₆^2?还原的负责酶，但其生理功能从未被确立。已知最著名的能够厌氧还原S₄O₆^2?为S₂O₃^2?的酶系统是膜结合、醌反应的钼酶TtrABC。由于ttr基因的同源物已在肠杆菌科以外的门中被鉴定，基于Ttr的S₄O₆^2?呼吸也可能存在于其他门中，包括希瓦氏菌。除Ttr外，Tsd细胞色素也是希瓦氏菌中S₄O₆^2?还原的一个有希望的候选者。Tsd在S. oneidensis的有氧S₂O₃^2?氧化中已被充分表征，但也被证明是Wolinella succinogenes和Campylobacter jejuni中厌氧还原S₄O₆^2?的原因。

本研究旨在分子水平上解析希瓦氏菌中S₄O₆^2?的还原过程，以希瓦氏菌sp. ANA-3（后文简称ANA-3）为模型。该菌株已被证明能够还原多种化合物，包括砷酸盐、锑酸盐、碘酸盐和铁，但其还原硫化合物的能力从未被检验。本研究通过对基因组进行详细分析，识别所有可能直接或间接参与S₄O₆^2?代谢的酶，并分析使用自杀克隆载体pKNG101进行框内基因缺失诱变获得的缺失突变体的表型。我们删除了每个可能参与S₄O₆^2?代谢的基因簇或它们的组合，并分析了它们与S₂O₃^2?和S₄O₆^2?相关的呼吸能力。我们还检查了推定的S₄O₆^2?呼吸酶的体外酶活性。最后，我们基于序列分析讨论了广泛存在的Ttr样酶的功能。

基因组分析揭示ANA-3中多种潜在的四硫酸盐还原酶

为了阐明ANA-3中S₄O₆^2?和S₂O₃^2?的代谢，首先需要确定该细菌基因组中编码可能参与转化这些化合物及其产物的酶的基因内容。通过BLAST分析，鉴定出一个多硫化物还原酶Psr同源物、一个四硫酸盐还原酶Ttr同源物以及八血红素四硫酸盐还原酶OTR。同时还鉴定出一个TsdBA系统，该系统可能负责S₄O₆^2?的还原和S₂O₃^2?的氧化。由于SO₃^2?是Ttr、OTR和Psr联合功能的标记物，我们寻找了除了Sir之外可能消耗或产生SO₃^2?从而干扰其随时间演变的酶。研究还揭示了硫酸盐（SO₄^2?）胞质同化还原途径的一部分，包括ATP硫酸化酶CysN、APS激酶CysC和PAPS还原酶CysH，它们允许从SO₄^2?产生SO₃^2?。

被鉴定的Ttr同源物参与四硫酸盐代谢

三联体SHEWANA3_RS03345-SHEWANA3_RS03350-SHEWANA3_RS03355被鉴定为潜在的ttrBCA基因簇。在最小培养基中测试K₂S₄O₆作为厌氧呼吸底物。即使在厌氧条件下，S₄O₆^2?也会随时间发生非生物转化，转化为S₃O₆^2?和S₂O₃^2?。野生型ANA-3菌株呼吸S₄O₆^2?导致其在9小时内被完全还原。此呼吸的连续还原产物是S₃O₆^2?、S₂O₃^2?、SO₃^2?。S₃O₆^2?浓度随时间的变化是双相的。初始阶段（0-6小时）对应于从5 mM S₄O₆^2?瞬时积累0.8 mM S₃O₆^2?，而第二阶段（6-9小时）对应于S₃O₆^2?的主要生物呼吸与S₄O₆^2?的直接呼吸并行，产生了S₂O₃^2?。有趣的是，S₃O₆^2?的初始产生阶段在野生型ANA-3菌株中比在化学对照中更快。这可以用SO₃^2?的生物生产来解释，因为已知SO₃^2?会与S₄O₆^2?反应产生S₃O₆^2?。在S₄O₆^2?代谢的最后阶段（9-58小时），积累的S₂O₃^2?被消耗以产生SO₃^2?和黑色沉淀物。从S₂O₃^2?生成SO₃^2?和HS^?表明Psr参与了S₂O₃^2?代谢。

为验证鉴定的ttrBCA同源基因在S₄O₆^{2?呼吸中的作用，使用自杀克隆载体pKNG101删除了ANA-3中的ttrBCA同源基因。所得缺失突变体（ANA-3 Δttr）对S₄O₆2?的还原显著慢于野生型，但并未完全消除。S₃O₆2?的产生和还原以及S₂O₃2?产生的动力学也显著减慢，而S₂O₃2?的还原未受影响。这些结果表明Ttr同源物在S₄O₆2?和S₃O₆2?的还原中起关键作用，正如先前在鼠伤寒沙门氏菌中对Ttr的演示。Δttr突变体中SO₃2?产生的延迟与缺失典型Ttr酶完全一致，该酶将S₃O₆2?转化为S₂O₃2?和SO₃2?。然而，这些结果意味着Ttr同源物并非ANA-3中还原S₄O₆2?的唯一酶。此外，它们表明该酶不参与S₂O₃2?的还原。}

为识别参与S₄O₆^2?呼吸的其他系统，使用自杀克隆载体pKNG101删除了ANA-3中的psrABC同源基因。所得Δpsr突变体对S₄O₆^2?、S₃O₆^2?和S₂O₃^2?的命运几乎与野生型相同。然而，该突变体完全丧失了S₂O₃^2?的消耗和SO₃^2?的产生。这些结果表明psr同源基因是ANA-3中唯一参与S₂O₃^2?呼吸的基因，并且它们不参与S₄O₆^2?的还原。

被鉴定的Ttr同源物与鼠伤寒沙门氏菌Ttr酶聚类

观察到S₄O₆^2?的还原仅部分基于ANA-3基因组中鉴定的ttr同源基因，这促使我们进一步分析鉴定的序列。典型的Ttr（以鼠伤寒沙门氏菌中表征的为例）是一种三聚体酶，是DMSO还原酶家族的成员。Ttr通过一个不含任何辅因子的亚基TtrC锚定在细胞质膜上。催化亚基TtrA携带一个钼辅因子和一个铁硫（Fe-S）簇，而电子转移亚基TtrB携带四个Fe-S簇。尽管三个Ttr亚基与其他钼酶中的对应物同源，但它们在ttr基因簇（ttrBCA）中显示出特定的基因组织和一级序列差异，从而实现特异性识别。ANA-3中鉴定的Ttr序列满足所有这些标准。然而，文献报道了此类Ttr同源物实际上是As(V)还原酶，在系统发育上与真正的Ttr和真正的Arr都不同。此外，有Ttr同源物被提议在S₂O₃^2?歧化中起作用。我们重建了一个系统发育树，其中包括来自呼吸S₄O₆^2?的鼠伤寒沙门氏菌、歧化S₂O₃^2?的Desulfolithobacter dissulfuricansGF1T、呼吸As(V)的Pyrococcus aerophilum和Anaeromyxobactersp. Strain PSR-1，以及ANA-3中鉴定的蛋白WP_011715816.1。重建的树揭示了Ttr样序列之间的巨大系统发育多样性，暗示了不同的功能。Ttr样As(V)还原酶形成两个不同的系统发育分支。在细菌中鉴定出的、参与硫化合物歧化的序列似乎代表了多种情况，包括潜在的As^V还原酶、真正的S₄O₆^2?还原酶和两个未知同源物的新分支。在Ttr子树中，来自ANA-3的WP_011715816.1序列与真正的Ttr聚类。初步蛋白质组学分析结果也表明Ttr同源物在S₄O₆^2?条件下而非As^V或S₂O₃^2?条件下特异性过量产生。这些结果与诱变实验确定的SHEWANA3_RS03355-SHEWANA3_RS03350-SHEWANA3_RS03345基因三联体（编码S₄O₆^2?还原酶活性）一致。

ΔttrΔpsr突变体无法呼吸四硫酸盐

为了进一步研究除Ttr外可能参与S₄O₆^2?还原的其他酶，构建了ANA-3的几个双缺失突变体菌株，包括ΔttrΔtsdA、ΔttrΔotr和ΔttrΔpsr。Tsd已被确定为S. oneidensisMR-1中氧气存在下的S₂O₃^2?氧化酶，但也被提议为限氧条件下S₄O₆^2?还原酶。在ANA-3 Δ