《Journal of Neuroendocrinology》：Biomarker-directed aptamer panels for diagnosis and differentiation of neuroendocrine tumors
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本文推荐了一项利用APTASHAPE平台筛选核酸适配体（aptamer）组合用于神经内分泌肿瘤（NET）诊断与分型的研究。研究发现，所选的适配体组合能有效区分健康个体与NET患者（AUC最高达0.87），并能鉴别小肠NET（siNET）与胰腺NET（pNET）（AUC 0.72）。此外，质谱分析还鉴定出ITIH2和IGHG3作为NET诊断的潜在新型生物标志物。该研究为开发非侵入性、多标志物的NET液体活检工具提供了新策略。
引言：神经内分泌肿瘤的诊断挑战
神经内分泌肿瘤（Neuroendocrine tumors, NETs）是一组起源于神经内分泌细胞的异质性肿瘤，最常发生于胃肠道和肺部。在胃肠道中，原发性NETs最常见于小肠（siNET）和胰腺（pNET）。这些肿瘤具有高度异质性的临床特征，从惰性生长到侵袭性转移性疾病均有发生，导致临床预后差异极大。目前，用于NET诊断、疾病进展评估和治疗效果监测最常研究的非侵入性生物标志物是嗜铬粒蛋白A（Chromogranin A, CgA）和5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）。然而，越来越多的证据表明这些标志物作为NET生物标志物存在局限性，例如CgA在siNET和pNET的诊断和监测中敏感性不足，而相当一部分肠胰NET患者的5-HIAA水平低于正常上限，且与疾病进展的关联性较弱。因此，亟需新型、准确、非侵入性的标志物来指导临床医生诊断和监测NET患者。多标志物联合检测被视为改善临床决策的潜在策略，而血浆蛋白质组学的表征具有强大的临床应用潜力。
APTASHAPE技术简介
本研究采用了一种名为APTASHAPE的新方法，用于在生物体液中评估和鉴定生物标志物。该技术从一个包含1015个修饰RNA寡核苷酸的随机库中筛选能与人类血浆蛋白质组中几乎任何蛋白质表位特异性结合的结合子，即核酸适配体（aptamers）。其核心在于，通过差异筛选，识别出一组有限的、对疾病相关蛋白质具有特异性的适配体，其原理是适配体与血浆样品中蛋白质结合的丰度差异反映了样本间靶蛋白表达或修饰的变化。本研究假设APTASHAPE平台可以筛选出用于NET无创诊断以及区分siNET与pNET的生物标志物导向型适配体组合。
研究方法与人群
研究共纳入92份血浆样本，其中68份来自NET患者（48例siNET，20例pNET），24份来自健康个体。所有样本随机平均分为开发集和测试集。开发集用于识别能够区分（1）健康个体与NET患者，或（2）siNET与pNET患者的适配体，并在测试集中评估这些组合的性能。APTASHAPE分析使用一个已建立的、富集了可识别人血浆样本中蛋白质的适配体库。基于丰度排名，研究选取了前350个最丰富的适配体进行分析。通过普通最小二乘（OLS）回归分析识别组间存在差异丰度的适配体，筛选标准是回归系数变化≥0.25且本雅明尼-霍赫贝格校正p值≤0.05。适配体组合的性能通过计算受试者工作特征曲线下面积（AUC）值及其95%置信区间（CI）进行评估，并与CgA和游离DNA（cfDNA）进行比较。此外，通过质谱分析（MS）对部分适配体进行交叉比对，以鉴定其潜在的蛋白质靶点。
研究结果：适配体组合的筛选与效能
1. 区分健康个体与NET患者
从350个高丰度适配体中，APTASHAPE分析在开发集中识别出68个在NET患者与健康个体间存在差异丰度的适配体，其中19个在NET中丰度升高，49个丰度降低。由这些适配体构成的组合在开发集中区分健康个体与NET患者的AUC为0.74，在测试集（验证集）中AUC提升至0.87，显示出优异的诊断潜力。具体性能指标见表2。
2. 区分小肠神经内分泌肿瘤与胰腺神经内分泌肿瘤
同样，从350个适配体中，分析识别出31个在siNET与pNET患者间存在差异丰度的适配体，构成了另一个适配体组合。其中，30个适配体在pNET中丰度更高，1个丰度更低。该组合在区分siNET与pNET的任务中，在开发集和测试集中均取得了0.72的AUC。相比之下，CgA在开发集和测试集中的AUC分别为0.66和0.79，而cfDNA在此区分任务中没有表现出判别能力（AUC分别为0.46和0.44）。
3. 样本量与效能分析
研究进行了事后效能分析。对于区分健康对照与NET患者，开发集和测试集的效应量（Cohen's d）分别为1.09和1.59，表明效应量大。所需样本量在开发集中为每组14-15人，测试集中为每组7-8人，本研究样本量已满足。对于区分siNET与pNET，开发集效应量为1.02（大），测试集为0.74（中等至大）。开发集中siNET组样本量（n=24）满足效能要求，但测试集中两组（siNET: n=24, pNET: n=9）均未达到最佳效能，特别是pNET组样本量不足，表明需要更大规模的队列来最终确立该组合在区分NET亚型方面的能力。
4. 潜在新型蛋白生物标志物的鉴定
通过交叉参考先前一项在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）研究中利用质谱鉴定出的适配体序列，本研究中用于区分健康个体与NET患者的适配体组合内有4个适配体被识别出具有已知的潜在蛋白质靶点。其中，三个适配体最可能结合间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2（Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2, ITIH2），另一个适配体最可能结合免疫球蛋白重链恒定区γ3（Immunoglobulin heavy constant gamma 3, IGHG3）。这两种蛋白被确定为NET诊断的潜在新型生物标志物。
讨论：研究的临床意义与未来展望
本研究首次探讨了利用APTASHAPE技术筛选的适配体组合在NET诊断和siNET与pNET分型中的性能。主要发现是两个独立的适配体组合分别能准确区分健康个体与NET患者，以及区分siNET与pNET患者。这凸显了适配体组合中所包含适配体的蛋白质靶点具有重要的生物学相关性。
当前NET的液体活检临床评估主要依赖CgA和5-HIAA等单一生物标志物测量，存在敏感性不足等问题。本研究采用的多标志物适配体组合方法有望克服单一标志物的局限性，同时保持与CgA和5-HIAA测量相当的诊断准确性，这与利用多组学技术诊断NET的既往尝试方向一致。虽然CgA在本研究队列中区分siNET与pNET的表现与适配体组合相当，但CgA通常被视为肿瘤负荷和疾病严重程度的标志物而非肿瘤定位指标，因此其作为区分亚型的单一标志物效用存疑。
通过质谱分析鉴定出的ITIH2和IGHG3是潜在的新型NET生物标志物。ITIH2在多种人类实体瘤中表达下调，而IGHG3在多种实体瘤中表达增加，但在NET中均未有过关联报道，值得进一步探索。同时，本研究中其他被选中适配体的蛋白质靶点也有待鉴定。
本研究的优势在于使用了特征明确的NET患者队列以及APTASHAPE平台。该平台高通量、多重分析能力以及相对较低的成本，增加了发现与NET诊断或分期相关的新型血浆蛋白生物标志物的潜力。然而，研究也存在局限性，包括缺乏外部验证、pNET患者样本量相对较小（开发集11例，测试集9例），以及健康对照年龄显著年轻于NET患者，可能导致某些差异反映的是年龄相关的血浆蛋白组成变化而非NET特异性变化。此外，由于大多数样本来自TNM IV期患者，无法评估该组合对早期NET的诊断性能，也因样本量限制未能探究其区分转移与非转移疾病的能力。
结论
研究表明，APTASHAPE平台是筛选用于NET诊断以及区分siNET和pNET的适配体组合的有效工具。此外，分析鉴定出ITIH2和IGHG3作为NET诊断的潜在新型生物标志物，值得在更大规模的NET患者队列中进行进一步探索。这项研究为开发基于多标志物适配体组合的非侵入性NET诊断和分型工具奠定了重要基础。
