《Plant Physiology and Biochemistry》：Melatonin activates plant defense against root-knot nematodes through the jasmonate pathway
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本研究探讨了柳杉科植物中酚性松香烷型二萜类化合物（如铁锈醇）的生物合成机制。针对其下游氧化步骤不清的问题，研究人员通过基因组挖掘、异源表达和系统发育分析，鉴定了台湾杉中两个新的CYP720B家族细胞色素P450酶（TcLO1和TcLO2），它们能够催化左旋海松二烯氧化形成铁锈醇。研究进一步揭示了CYP720B与二萜合酶（DTS）基因在柏亚纲植物基因组中普遍存在头对头紧密连锁的保守结构，为理解针叶树二萜生物合成与基因组进化提供了新见解。
在针叶树的漫长演化史中，它们发展出了复杂而精妙的化学防御系统，其中一类名为酚性松香烷型二萜的化合物扮演着关键角色。这类化合物不仅赋予树木心材卓越的耐腐性，如著名的台湾杉（Taiwania cryptomerioides）就因其富含铁锈醇（ferruginol）而闻名，而且其中一些衍生物（如台湾杉醌类）还显示出潜在的抗癌活性，具有重要的医药价值。然而，尽管这类化合物生态和药理意义重大，其生物合成的完整路径，特别是从共同前体左旋海松二烯（levopimaradiene）到铁锈醇的关键氧化步骤，多年来一直是个未解之谜。同时，在松科植物中，负责二萜树脂酸合成的细胞色素P450酶（CYP720B）已有较多研究，但在富含酚性松香烷的柏科及其近缘类群中，相应的氧化酶及其在基因组中的组织形式却鲜为人知。为了填补这些知识空白，一项研究应运而生，旨在揭示台湾杉中铁锈醇合成的酶学机制，并探索相关基因在针叶树基因组中的进化模式。这项研究最终发表在了《Plant Physiology and Biochemistry》期刊上。
为了回答上述问题，研究人员综合运用了多种关键技术。首先，他们通过生物信息学方法，在柳杉（Cryptomeria japonica）基因组中挖掘与已知二萜合酶（DTS）基因相邻的细胞色素P450候选基因。接着，从台湾杉的转录组中克隆了同源基因（TcLO1和TcLO2）。随后，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大肠杆菌（Escherichia coli）异源表达系统，对候选P450酶的催化功能进行验证，通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析其代谢产物。此外，通过基因组PCR证实了台湾杉中TcLO2与一个新鉴定的二萜合酶基因TcKSL9存在紧密的基因组连锁。研究还进行了大规模的基因组调查，在多个柏亚纲和松科植物基因组中搜索CYP720B–DTS基因对。最后，通过最大似然法构建系统发育树，并对基因对所在的基因组区域进行微共线性分析，以阐明其进化关系。
3.1. 候选CYP720B基因的鉴定与克隆
通过对柳杉基因组的分析，研究人员在染色体2和7上发现了两个头对头紧密排列的CYP720B–DTS基因对，其间隔距离仅约2kb。从台湾杉中克隆到了两个同源基因TcLO1和TcLO2（后正式命名为CYP720B76和CYP720B22）。转录组数据显示，这两个基因在木材组织，尤其是心材过渡区高表达，这与铁锈醇的积累部位相符。
3.2. TcLOs作为左旋海松二烯氧化酶的功能表征
在酵母和大肠杆菌中的异源表达实验表明，表达TcLO1或TcLO2的工程菌株，其左旋海松二烯的积累量减少，并产生了两个新产物。通过GC-MS谱图比对，这两个产物分别与松香三烯（abietatriene）和铁锈醇的标准谱图匹配。这表明TcLO1和TcLO2能够催化左旋海松二烯发生氧化反应，生成松香三烯中间体，并进一步氧化形成铁锈醇。
3.3. TcLO2在台湾杉中与一个DTS形成保守的头对头基因对
基因组测序揭示，TcLO2与一个新发现的二萜合酶基因TcKSL9以头对头方向排列，间隔3,071 bp。功能实验证实TcKSL9是一个左旋海松二烯合酶。因此，TcLO2和TcKSL9构成了一个物理上连锁、功能上连续的生物合成基因对。
3.4. 柏科植物中的CYP720Bs形成一个与松科已知酶不同的进化枝
系统发育分析显示，TcLO1和TcLO2与所有已功能表征的松科CYP720B酶明显分开，形成了一个独立的柏科-红豆杉科进化枝，这表明柏科与松科的CYP720B酶在进化上遵循了不同的轨迹。
3.5. CYP720B–DTS基因对在针叶树谱系中的分布
对多个针叶树基因组的调查发现，头对头的CYP720B–DTS基因对广泛存在于柏科、红豆杉科、罗汉松科和南洋杉科（统称柏亚纲）中。在部分松科植物（如火炬松）中也检测到类似基因对，但在银杏、苏铁、买麻藤纲以及被子植物（如水稻）中均未发现。
3.6. 柏亚纲植物中CYP720B–DTS基因对的进化关系
对基因对成分的系统发育和微共线性分析得出了重要结论：
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系统发育模式：大多数柏亚纲的成对DTS和CYP720B蛋白分别聚集在柏亚纲特异性的进化枝内，与松科的成对基因明显分开。
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微共线性证据：在柏亚纲各物种（如台湾杉、柳杉、杉木、竹柏）中，基因对两侧±5 Mb区域内存在大量同源基因的互惠最佳匹配（RBH）连接，表明局部基因组环境是保守的。然而，在分析的松科植物（如油松）与柏亚纲物种之间，则未检测到这种局部微共线性。
综合以上结果，本研究得出了明确的结论并进行了深入讨论。首先，研究成功鉴定了台湾杉中两个新的CYP720B家族P450酶（TcLO1和TcLO2），它们能够催化从左旋海松二烯到铁锈醇的关键氧化步骤，从而阐明了柏科植物中这一重要酚性二萜的生物合成通路。其次，研究揭示了一个普遍存在的基因组特征：CYP720B与DTS基因在柏亚纲植物中以头对头的方式紧密连锁，形成保守的基因对结构。
这一发现具有多重重要意义。在酶学机制上，TcLOs的功能与被子植物（如丹参）中催化类似反应的CYP76AH家族酶形成了鲜明的对比。尽管最终产物相似，但柏科和唇形科植物动用了进化上完全不同的P450家族来完成氧化步骤，这是功能趋同进化（convergent evolution）的一个典型例证，揭示了自然界中不同谱系独立“发明”相似化学解决方案的奇妙现象。
在基因组与进化层面，研究提供的证据（包括基因对的广泛分布、成对基因特有的系统发育聚类以及柏亚纲内保守的微共线性）强烈支持这样一个观点：CYP720B–DTS基因对结构在柏亚纲的共同祖先中就已建立，并在此后超过2亿年的演化历程中被长期保留下来。这种长期维持的基因紧密关联，可能有利于协调基因表达、共同遗传，从而优化二萜防御化合物的生产，为柏亚纲植物在历史上经历多次环境剧变（如二叠纪-三叠纪大灭绝事件）时提供了适应优势。虽然部分松科植物也存在类似基因对，但其系统发育和基因组背景与柏亚纲不同，提示其可能独立起源。
总之，这项研究不仅解析了具有生态和药用价值的铁锈醇的生物合成途径，更首次在基因组尺度上揭示了针叶树，特别是柏亚纲植物中，二萜生物合成基因的一种古老而保守的基因组构型。这为理解植物特殊代谢通路的进化、基因组组织与生态适应性之间的关联提供了关键的新见解，也为未来利用合成生物学手段生产这些有价值的萜类化合物奠定了重要的分子基础。
