《Plant Stress》：Integrative network analysis and GWAS identify
TaERF-4A and
TaFd-5B as key regulators of low-nitrogen tolerance in wheat
编辑推荐：
为解决氮肥效率低下制约小麦生产的问题，本研究整合了水培幼苗表型分析、全基因组关联研究（GWAS）、调控网络（wGRN）分析和功能遗传学验证，解析了284份小麦种质在低氮胁迫下的适应性。研究揭示了低氮胁迫下植株生物量与氮积累的自然变异，鉴定了与耐受性相关的70个显著关联位点，并筛选出TaERF-4A、TaHD-ZIP-5A和TaFd-5B作为关键候选基因。其中，TaERF-4A和TaFd-5B的功能丧失突变体表现出对低氮胁迫的敏感性增强，证实了它们在维持低氮条件下生物量与氮稳态中的作用。研究还鉴定出TaFd-5B启动子区的功能性T/C多态性，并开发了可用于分子育种辅助选择（MAS）的诊断性分子标记。该研究为解析小麦低氮响应网络提供了关键元件，并为培育氮高效小麦品种提供了可操作的表型指标、优良种质、验证的基因靶点和育种可用的分子标记。
氮是植物生长发育必需的大量元素，也是决定农业生产力的核心因子。小麦作为全球最重要的主粮作物之一，其高产优质依赖于大量的氮肥投入。然而，施入农田的氮肥仅有少部分被作物吸收利用，造成了严重的资源浪费和环境污染。同时，土壤中氮素（特别是植物可吸收的硝酸盐和铵盐）的供应常常成为限制作物生长的关键因子。为了在保障粮食安全的前提下减少氮肥施用量，培育氮利用效率（NUE）高的小麦品种成为一项紧迫的挑战。因此，深入解析小麦响应低氮胁迫的遗传基础与调控网络，鉴定控制氮吸收、利用和耐受性的关键基因，对于实现绿色、可持续的农业生产具有重要的理论与应用价值。
在分子层面，植物对氮的响应是一个复杂的调控过程，涉及多种转录因子、信号通路和代谢酶。虽然在拟南芥、水稻等模式作物中已取得重要进展，但在小麦中，对低氮耐受性的系统性功能解析仍然有限。全基因组关联研究（GWAS）是挖掘复杂性状遗传位点的有力工具，但如何从成百上千的关联位点中快速锁定具有关键调控功能的候选基因，是当前面临的一个主要瓶颈。针对这些问题，来自浙江大学的研究团队开展了一项整合多组学与功能遗传学的研究，其成果发表在《Plant Stress》期刊上。
为开展这项研究，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，对包含284份来自全球小麦主产区的自然群体进行了水培幼苗表型分析，精确测定了正常氮（NN）和低氮（LN）条件下的生物量与氮积累相关性状，并计算了六个相对低氮响应指数来量化耐受性。其次，利用小麦90K SNP芯片对群体进行基因分型，并以此为基础进行了GWAS分析。接着，将GWAS定位的区间与一个整合性的小麦基因调控网络（wGRN）以及水稻氮代谢相关同源基因信息相结合，对候选基因进行了优先排序。然后，在极端耐受和敏感基因型中进行了候选基因的表达分析。最后，利用EMS（乙基甲磺酸）诱变产生的功能缺失（stop-gained）突变体，对筛选出的关键候选基因TaERF-4A和TaFd-5B进行了反向遗传学功能验证，并针对TaFd-5B启动子区的功能多态性开发了dCAPS（衍生性酶切扩增多态性序列）分子标记。
幼苗生物量与氮相关性状在低氮响应中表现出显著的遗传变异
研究人员在水培系统中对284份小麦种质进行了表型鉴定。结果表明，低氮处理显著抑制了地上部的生长和植株的氮积累，但促进了根系的生长，导致根冠比增加，揭示了在生物量分配和氮相关可塑性方面存在广泛的自然变异。通过计算六个相对响应指数，研究有效地将胁迫响应与基础生长活力分离开来。
鉴定出对低氮表现出极端反应的小麦基因型
通过分析相对响应指数之间的相关性，研究发现地上部和根系的响应存在协同调控。基于综合响应模式，研究筛选出了极端低氮耐受（如Azulon、Chuanmai41）和敏感（如CA1119、Emai23）的基因型，用于后续分析。来自中国不同主产区（黄淮、长江、北部冬麦区）的种质在低氮响应上表现出地理分化。
鉴定出与低氮耐受性相关的遗传位点及其多效性基因组区域
以六个低氮响应指数为性状进行GWAS分析，共鉴定出70个显著的标记-性状关联位点（MTA）。这些位点主要分布在A基因组上，部分SNP与多个指数关联，表明存在协调植物对低氮胁迫响应的多效性区域。曼哈顿图显示，在4A、5A和5B染色体上存在显著关联峰。
候选基因优先排序显示TaERF-4A、TaHD-ZIP-5A和TaFd-5B是低氮响应的关键调控因子
研究人员结合wGRN网络分析和水稻氮代谢同源基因信息，对GWAS区间内的基因进行优先排序，最终筛选出220个高优先级候选基因。其中，TaERF-4A（编码乙烯响应因子）、TaHD-ZIP-5A（编码同源域-亮氨酸拉链转录因子）和TaFd-5B（编码铁氧还蛋白）被确定为高置信度候选基因。在极端基因型中的表达分析显示，这些基因的表达模式存在基因型依赖性差异：低氮胁迫诱导TaERF-4A表达，且在敏感材料中诱导更强；TaHD-ZIP-5A在耐受材料中的表达抑制较弱；TaFd-5B在耐受材料中的表达抑制则更强。
利用EMS突变体验证了TaERF-4A和TaFd-5B在低氮响应中的作用
为进行功能验证，研究获得了TaERF-4A和TaFd-5B的EMS诱导的功能缺失突变体。表型分析表明，与野生型相比，erf-4a和fd-5b突变体在低氮条件下表现出更严重的生长抑制，其相对地上部干重、氮积累指数显著降低，而相对根干重响应也减弱，证实了TaERF-4A和TaFd-5B对于维持低氮条件下的生物量和氮稳态是必需的。
TaFd-5B启动子的顺式调控变异与分子育种策略
进一步分析发现，TaFd-5B启动子区存在一个T/C多态性，其中有利的‘C’等位基因与更好的低氮表现相关。研究为此开发了一个诊断性的dCAPS分子标记，可用于区分这两个等位基因，为分子标记辅助选择（MAS）提供了直接可用的工具。
研究结论与意义
本研究通过整合可控表型平台、相对响应指数、GWAS和网络引导的基因优先排序框架，揭示了小麦幼苗响应低氮胁迫的多基因、器官协同调控的遗传架构。研究将关联信号与小麦基因调控网络（wGRN）整合，优先筛选出TaERF-4A、TaHD-ZIP-5A和TaFd-5B三个关键候选基因。其中，TaERF-4A和TaFd-5B通过EMS功能缺失突变体被验证是维持低氮条件下生物量与氮稳态所必需的。这两个基因分别涉及乙烯信号和氧化还原稳态/氮同化途径，其表达模式的基因型差异表明，最佳的耐受性依赖于对它们活性的精准时空调控，而非简单的表达量高低。此外，研究鉴定出的TaFd-5B启动子功能性多态性及其配套的dCAPS标记，直接将基因变异与表型关联起来，为分子育种提供了“桥梁”。
这项研究的核心意义在于，它不仅解析了小麦低氮耐受性的多基因本质，更重要的是通过“网络优先排序-功能验证-标记开发”的整合策略，成功地将GWAS发现的统计关联转化为具有明确生物学功能和育种应用价值的遗传元件。该工作为小麦氮效率的遗传改良提供了一套多层次、可操作的资源包：包括稳健的表型评价指标、极端耐受/敏感的种质资源、经过功能验证的基因靶点及其所在的调控网络上下文，以及一个可直接用于育种的分子标记。这些成果有望加速氮高效小麦品种的选育进程，为在减少氮肥投入的同时维持作物生产力、推动农业可持续发展提供重要的科学基础和技术支撑。
