《PROTEOMICS》：Single-Cell Nanodroplet Processing Proteomics Pipeline for Analysis of Human-Derived Microglia
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本文介绍了一种结合荧光激活细胞分选（FACS）、纳升级液滴处理（nanoPOTS）与高场不对称波形离子淌度谱-数据非依赖采集（FAIMS-DIA）质谱技术的创新工作流程，首次对人死后大脑皮层来源的小胶质细胞进行了无标记单细胞蛋白质组学（scProteomics）分析。该方法平均从单个小胶质细胞中鉴定出1039种蛋白质，证明了在单细胞水平探索小胶质细胞异质性的可行性，并揭示了驱动其变异的线粒体蛋白通路，为在阿尔茨海默病（AD）等神经系统疾病中识别功能相关蛋白靶点提供了新的工具和见解。
引言
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻免疫细胞，动态响应CNS损伤、感染和组织稳态。单细胞组学技术的发展揭示了小胶质细胞具有高度多样性和异质性。尽管单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和飞行时间流式细胞术（CyTOF）等研究已鉴定出多种小胶质细胞转录亚型，但这些方法提供的是蛋白质丰度的间接信息或有限数量的目标。鉴于许多神经病理是蛋白质驱动的，如Aβ斑块、神经原纤维缠结等，单细胞蛋白质组学（scProteomics）有望为理解小胶质细胞异质性提供有价值的见解。本文首次提出一种结合荧光激活细胞分选（FACS）、低温保存、压电细胞分选、纳升级液滴处理（nanoPOTS）和高场不对称波形离子淌度谱-数据非依赖采集（FAIMS-DIA）质谱分析的工作流程，应用于人脑皮层来源的小胶质细胞，进行了无标记单细胞蛋白质组学分析。
实验方法
材料与芯片制备
实验所用试剂包括n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、碘乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵（ABC）、甲酸（FA）、胰蛋白酶、Lys-C等。纳升级液滴处理（nanoPOTS）芯片采用光刻、湿法刻蚀和硅烷化工艺制备，包含48个纳米孔。芯片表面用全氟硅烷（PFDS）处理，形成被疏水表面环绕的亲水纳米孔。
人脑样本来源与微胶质细胞分离
人脑样本来源于一位83岁女性捐赠者的内侧额叶皮质。小胶质细胞分离采用已发表的方法。组织样本经过匀浆、过滤、Percoll密度梯度离心去除髓鞘碎片后，通过磁珠分选（MACS）富集CD11b+细胞，再利用FACS分选CD11b+/CD45+/7AAD?的细胞，分选后细胞在含40%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）的RPMI-1640培养基中冷冻保存。
单细胞分选与纳液滴样本处理
使用CellenONE仪器进行压电分选，将单个细胞沉积到nanoPOTS芯片的纳米孔中。基于明场图像实时分选，并设定细胞直径和形态参数以排除碎片和细胞团。在芯片上进行样本处理：加入含有DDM和DTT的提取缓冲液进行裂解和还原，再加入IAA进行烷基化，最后加入Lys-C和胰蛋白酶进行酶解，反应后被甲酸淬灭并干燥。
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析与数据处理
使用配备FAIMS Pro接口的Orbitrap Astral质谱仪进行分析，采用数据非依赖采集（DIA）模式。原始数据通过Spectronaut软件，使用DirectDIA+（无库）策略搜索人类蛋白数据库。对前体和蛋白进行严格质量控制（FDR < 1%）和过滤。缺失值插补后，通过主成分分析（PCA）探索数据变异来源，并使用基因本体（GO）术语富集分析功能通路。
结果
单细胞蛋白质组学（scProteomics）平台与鉴定深度
该工作流程如图1A所示。在缺失值插补前，从47个单个人源小胶质细胞中，平均鉴定出3290±1059个前体和1039±283个蛋白质（图1B，C）。从人小胶质细胞系HMC3的单个细胞中鉴定到的蛋白数量更高。在至少50%的单个小胶质细胞中观察到了50%的前体，显示了较好的覆盖度。鉴定到的蛋白质中包含CD45（PTPRC）、CD11b（ITGAM）等小胶质细胞标志物，以及5%的已知老化小胶质细胞（HuMi_Aged）富集蛋白（图2）。
小胶质细胞与HMC3细胞的蛋白质组异质性
对小胶质细胞的主成分分析显示，对第一主成分贡献最大的蛋白质包括TUBB2A、TUBA4A、CAMK2A等，对第二主成分贡献大的包括ATP1F1D、SLC25A4、PPT1等（图3A，B）。分析发现，第一主成分与细胞直径显著相关。将蛋白质汇总到GO生物过程术语后进行PCA分析，发现导致小胶质细胞群体变异的主要通路是线粒体相关过程，包括呼吸、线粒体ATP合成和氧化磷酸化等（图3C，D）。驱动这些GO术语的蛋白质包括NADH脱氢酶（复合物I）、细胞色素b-c1（复合物III）、细胞色素c氧化酶（复合物IV）、F1-ATPase（复合物V）和Na+/K+-ATPase复合物的成员。微管相关过程和有丝分裂也是重要的变异来源。对HMC3细胞的PCA分析则显示，主要贡献蛋白为各种组蛋白、SNRPB/N、SRSF7、APOC1和IPO4等（图4A，B），GO富集分析则指向与真核翻译起始因子、载脂蛋白、补体因子等相关的通路（图4C，D）。细胞直径仅与HMC3细胞的第三主成分相关。
讨论
蛋白质组覆盖度
本研究首次将无标记单细胞蛋白质组学应用于人死后脑皮层分离的单个小胶质细胞。小胶质细胞在死后活性迅速下降，且细胞尺寸小、蛋白质质量有限。通过FACS富集结合nanoPOTS技术，本研究实现了与单细胞RNA测序相当的鉴定数量，为在单细胞水平上研究小胶质细胞的转录和空间异质性开辟了新途径。
单细胞小胶质细胞群体的蛋白质组变异性
结果表明，线粒体蛋白是解释小胶质细胞个体间变异的关键因素。小胶质细胞在激活和分化过程中经历能量代谢变化。静息态小胶质细胞主要依赖氧化磷酸化，而促炎群体依赖有氧糖酵解，抗炎群体依赖线粒体氧化。本研究捕获的这些与呼吸、质子跨膜转运、线粒体ATP合成相关的GO术语，可能反映了这些代谢转变。此外，细胞骨架蛋白（如微管蛋白）的变异与细胞大小相关，这也与之前关于细胞大小是单细胞蛋白质组变异主要来源的观察一致。而在HMC3细胞中，细胞大小对变异的贡献较小，且主成分解释的总方差低于原代小胶质细胞，表明永生化的HMC3细胞在蛋白质组景观上更为同质。
结论
本研究描述了一种用于分析人脑来源单个小胶质细胞的单细胞蛋白质组学（scProteomics）流程。该流程包括基于CD11b标记的细胞富集、FACS辅助分选、低温保存、二次分选、nanoPOTS芯片处理及质谱分析。实现了平均每个细胞约1000种蛋白质的定量，与单细胞RNA测序水平相当。这种直接测量单细胞内全局蛋白质丰度的正交方法，将补充现有的转录组研究，揭示对理解小胶质细胞表型和亚型至关重要的独特蛋白质表达模式，特别是在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的背景下。
