《Small Methods》：Particle-Based Detection of Surface Chemistry via Optical Microscopy—Integrating Microfluidics, Light-Induced Activity of Colloids and Data Science
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本文介绍了一种基于颗粒解析的方法，用于通过结合微流控技术和LED照明的光学视频显微镜进行单颗粒轨迹分析，从而确定微颗粒的孔隙率和表面积。该技术提供了一种独特的分析优势组合，解决了传统方法（如BET氮气吸附法）的关键局限，尤其适用于微量样品、可进行颗粒级别的异质性分析，且工作流程快速简单，为材料表征中的低样品量应用提供了强大、易得的替代方案。
引言
纳米和微米颗粒在现代科技中扮演着重要角色，其表面特性对材料功能至关重要。孔隙率是描述材料结构特征的关键参数，通常定义为孔体积与总体积之比，并广义地涵盖包括比表面积在内的相关特性。多孔颗粒的应用广泛，如催化剂载体、药物递送载体、太阳能电池、气体吸附、锂离子电池和生物传感等。然而，准确表征多孔颗粒的孔隙率面临挑战。传统的技术，如Brunauer-Emmett-Teller (BET)氮气吸附法、气体膨胀法、小角X射线散射(SAXS)和电子显微镜(SEM/TEM)等，均存在局限性，包括可测量的孔径范围限制、分析准确性、所需样品量大以及样品制备过程复杂。更重要的是，大多数现有技术提供的是整个宏观样品的平均信息，缺乏对单个微米尺度颗粒进行定量分析的颗粒基方法。目前，只有透射电子显微镜(TEM)和聚焦离子束扫描电镜(FIB-SEM)能实现纳米级别的颗粒分析。为了满足现代应用对颗粒基孔隙率分布信息的需求，急需发展新的分析技术。
测量原理
本文提出的新方法旨在实现颗粒级别的表面积估算，其核心在于利用简单的光学显微镜，结合微流控技术和光照明。该方法仅需廉价的测量设备，可集成到任何实验室作为标准日常任务。测量在由微流道构成的探测池中进行，其中含有分散在溶解了光敏性偶氮苯表面活性剂的水性悬浮液中的分析物（微颗粒）。
该技术的物理基础是局部光驱动扩散渗透(l-LDDO)效应。当光照射时，表面活性剂的两种异构体（表面活性高的反式异构体trans和表面活性低的顺式异构体cis）发生光异构化转换。由于不同的表面活性，吸附在颗粒界面的反式表面活性剂分子光异构化产生的顺式异构体会被不断排出，形成持续的通量，该通量与颗粒的有效表面积成正比。这种持续的顺式异构体通量导致颗粒附近顺式异构体浓度失衡，沿着界面平行方向产生浓度梯度，进而引发沿该方向的渗透压梯度。这诱导了沿固体-液体界面的“流体流动”，即扩散渗透。对于沉积在基底上的颗粒，这种效应会导致颗粒从底部基底轻微悬浮（抬升）。由于光诱导的化学活性取决于反式-顺式异构体交换通量，颗粒的上游悬浮速度与此通量成正比，因此也与其有效表面积成正比。
当悬浮的颗粒暴露于外加的层流时，颗粒受到的剪切应力与其悬浮高度成正比。悬浮高度和由此产生的光诱导速度取决于通量的大小，因此也与吸附的反式异构体净量（与参数有效表面积×反式异构体表面覆盖率成正比）相关。对于尺寸相同、体材料相同的颗粒（如本工作中使用的二氧化硅微球），其迁移率的变化仅由有效表面积引起。这种迁移率可以通过视频显微镜记录，并反向解释为单个颗粒的表现表面积，并对所有穿过光学视野区域的颗粒进行量化，从而实现颗粒级别的分析。该方法不仅提供总表面积的定量信息，还能深入了解表面积在单个颗粒分布中的情况。
结果与讨论
测量原则
检测方法如图所示，所需硬件包括安装在具有视频记录功能的光学显微镜上的集成微流控池、泵系统和提供均匀强度照明的光源。分析物与光敏表面活性剂水溶液混合后注入流体池，颗粒沉降后施加流体。光照使颗粒具有化学活性，导致其垂直悬浮到更高剪切区域，从而增加其漂移速度，该速度与孔隙率等界面特性成比例。这种光诱导漂移速度是结合微流控技术实现颗粒基化学光学显微镜分析的关键机制。通过对每个穿过相机视野的颗粒进行轨迹跟踪和速度计算，获得表征颗粒界面特性的LDV分布。在具有不同孔隙率的颗粒二元混合物中，速度差异与其表面积唯一相关。
数据记录细节
以尺寸相近的多孔PSiO2和普通SiO2二氧化硅颗粒的混合物为例。样品在蓝光照明下测量LDV。光照开启后，由于表面积不同，普通SiO2颗粒显示出相对较小的LDV，而多孔PSiO2颗粒则表现出显著的速度增加。二元混合物的平均LDV介于两者之间。为了进行准确的颗粒识别，需将速度与颗粒尺寸关联进行分类，而不是使用时间平均速度。根据流体动力学基本原理，悬浮颗粒的速度是其半径和轴向垂直悬浮距离的函数。因此，将颗粒穿过视野的平均速度绘制为其像素面积的函数，数据点会形成速度值簇。对于混合物，可以使用无监督机器学习算法（如高斯混合模型）自动识别数据中的自然分组（簇）。每个簇内的颗粒被认为具有相似的表面化学性质。
定量分析
在定性检测和分类的基础上，可以进行定量评估。通过计算每个颗粒类型的轨迹数量，可以确定二元混合物中各颗粒类型的数量分数，并与根据样品制备已知质量比计算的理论数量分数进行比较。量化采用了两种原理，均得到相似精度。第一种方法是统计所有按类型分类的轨迹数量；第二种方法则结合了颗粒动量。通过系统改变非多孔和多孔颗粒的质量比，实验测得的数量分数与理论值吻合良好，平均颗粒类型量化误差约为20%。此外，测量的总颗粒浓度也与调整的浓度比例一致。
该方法还能通过评估从测量的颗粒轨迹得出的颗粒表面积加权分布，来量化宏观样品的平均孔隙率。具体通过公式计算，其中参数X代表与完全多孔或完全非多孔微颗粒相关的特征表面积，加权因子是各颗粒类型在测量群体中的相对频率。将此方法估算的氮气吸附饱和体积与对相同干燥二元混合物进行的实际氮气吸附测量结果进行比较，显示出良好的一致性，平均绝对偏差仅为9%。同样，在已知参考颗粒表面积的情况下，可以近似估算样品的平均比表面积。
测量优势
与传统的氮气吸附技术相比，LDV方法具有多个实际和分析优势：
- 1.
样品需求量极低：仅需微克或更少级别的样品量，比氮气吸附法所需样品量低多个数量级，特别适用于稀有、昂贵或难以合成的材料。
- 2.
数据采集快速：可在秒到分钟级别内记录和分类单个颗粒的速度轨迹，相比氮气吸附法耗时（8-43小时）缩短了约四个数量级。
- 3.
颗粒级分辨率：能够捕获单个颗粒行为，直接评估样品内的异质性，而氮气吸附仅提供整体平均特性。
- 4.
应用广泛：该原理适用于任何界面，包括多孔表面以及相同尺寸颗粒的不同表面修饰，如表面官能团、聚合物刷涂层和微凝胶等。但需要对不同的颗粒类型校准相应的参考库。
- 5.
适用于多孔胶体：主要与界面相互作用的表面活性剂，其检测与可及表面积相关。对于具有足够大孔径允许表面活性剂扩散的内部结构，内表面积也可能变得相关。
需要注意的要点
样品制备
确保颗粒与表面活性剂溶液的精确和一致混合至关重要，因为颗粒的泳动迁移率和光诱导漂移对表面活性剂浓度、离子强度和样品制备高度敏感。推荐进行三次清洗循环并使用一致的平衡时间。
离群值去除
在进行聚类分析前，必须去除因跟踪错误、样品杂质或颗粒团聚产生的离群值，包括碰撞颗粒、异常大直径颗粒、进出视野的颗粒以及颗粒团簇。这些离群值会影响聚类性能，需通过路径长度、速度标准偏差和面积分位数等方法进行识别和移除。
数据库设计
颗粒识别的核心在于比较数据库和分析物数据的LDV分位数。为实现准确匹配，数据库必须在与分析物相同的测量条件下构建，且其中颗粒的物理和化学性质明确已知。数据库应涵盖流动速率、光照强度和波长等受控参数，并需按颗粒尺寸和表面化学性质（如孔隙率、表面官能团、材料）进行分类。尤为重要的是，数据库必须在一系列颗粒浓度下进行迭代测量，因为颗粒活性受邻近活性颗粒距离的影响，浓度变化会导致LDV改变。数据库中的单分散数据浓度需要与分析物混合物中各物种的绝对浓度相匹配，而非总浓度。
数据库的长期稳定性
确保数据库的长期稳定性依赖于实验的可重复性，包括物理和化学条件的一致性，以及测量设备状态的稳定和调整。这要求样品制备、表面活性剂浓度、流体动力学参数和光学设置等在所有测量中保持严格一致。
泵类型
可靠的材料识别需要稳定流速的泵送系统。本工作中使用的高精度注射泵可提供低而平稳的流速，脉冲和噪声极小，确保颗粒运动一致，形成紧凑、分离良好的数据簇。相比之下，蠕动泵或齿轮泵会产生脉动流，导致颗粒运动不均匀、数据簇重叠，可能造成错误分类。
图像采集时间
准确的数据解读依赖于视频采集。过长的曝光时间会导致快速运动的颗粒出现拖影，从而错误测量尺寸和错误分类数据簇。应尽可能缩短曝光时间以减少运动模糊并提高时间分辨率。短曝光能保持颗粒的真实球形几何形状，而长曝光则会人为增加计算的像素面积和表观纵横比，引入尺寸误差。
实验方法
材料
使用平均粒径为5微米的单分散介孔二氧化硅胶体（多孔）和非多孔实心二氧化硅胶体（普通）。合成了偶氮苯-containing表面活性剂C4-Azo-OC6TMAB，其临界胶束浓度为0.5 mM，实验中使用浓度为2 mM的溶液。
样品制备
将二氧化硅微颗粒水分散液与表面活性剂溶液混合，制备不同浓度和比例（多孔与普通）的二元混合物。样品至少平衡24小时后，注入微流控腔室，颗粒沉降后，在固定体积流量下进行测量。
光学显微镜设置、图像采集和光源
使用倒置光学显微镜，配置双波长照明系统，可对样品进行455 nm（蓝光）和625 nm（红光）的均匀全局照射。蓝光触发光敏表面活性剂的光异构化，而红光则不触发。使用CMOS相机以每秒30帧的速度进行视频采集。
氮气吸附分析
将多孔和非多孔颗粒的混合悬浮液按所需质量比混合，洗涤并冻干。干燥样品在真空下激活后，使用商用分析仪测量氮气吸附-脱附等温线。
结论
本工作介绍了一种利用光学视频显微镜进行颗粒级别孔隙率测定的新型分析技术。该测量原理基于记录沉积颗粒在外部流动中的尺寸和被动运动。分散液中含有光响应表面活性剂，在光照下使所有胶体产生活性。在外部流动下，这种活性导致颗粒沿流线方向产生独特的运动速度，该速度表征了颗粒的化学和界面特性。记录的轨迹可以进行分析，并与预定义的数据进行比较，以确定每个穿过颗粒的化学和界面性质。这种基于成像的方法同时测量颗粒的物理特性和化学/界面特性，遵循颗粒基检测原理。
分析遵循一个四步流程：一致的样品制备、使用光学视频显微镜结合微流控和LED照明的数据采集、使用数据处理流程的轨迹分析，以及最终报告用于颗粒类型和总浓度的定性和定量评估。该方法通过模型二氧化硅微颗粒进行了验证，在比较调整后与测量的样品组成时，平均准确度达到20%。此外，基于群体比例加权平均估算的二元混合物有效净表面积，与在相同样品组成下通过传统BET分析获得的净表面积高度吻合。
