《Horticulture Advances》：Functional characterization of MdIMA1 from apple (Malus dosmesita) in modulating iron homeostasis
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这篇研究综述深入探讨了苹果（Malus domestica）中铁（Fe）稳态调控的新机制。文章首次系统表征了苹果IMA（IRON MAN）多肽基因家族成员MdIMA1，揭示其作为缺铁响应的核心调控基因，在模式植物拟南芥和番茄以及苹果愈伤组织中的过表达均能显著增强植物的缺铁耐受性，通过激活根际酸化、促进铁吸收与转运相关基因（如H+-ATPase、FCR、IRT1等）的表达，有效促进了铁离子的吸收与利用。该研究为理解果树铁营养调控网络提供了新见解，并为通过遗传工程培育耐缺铁、富铁型作物品种提供了重要的靶点基因资源。
引言
铁（Fe）是植物生长和代谢所必需的微量营养元素，是多种蛋白质和酶（如铁蛋白、亚铁氧化酶、铁硫蛋白）的关键组分，在光合作用、线粒体能量代谢和电子传递链核心部件的形成中不可或缺。尽管地壳中铁含量丰富，但在有氧和碱性条件下，其游离态的溶解度低，生物可利用性常常受限，导致植物中普遍存在缺铁现象。植物缺铁会损害光合效率，破坏叶绿素生物合成，早期症状表现为叶脉间失绿，严重时导致叶片白化、生物量积累受抑制，最终降低作物产量和品质。此外，以缺铁作物为主食的地区，缺铁性贫血是全球性的健康风险。为应对铁的可变性供应，植物进化出了复杂的调控机制，包括上调与铁吸收、转运和稳态相关的基因表达。
植物主要通过两种策略获取铁。策略I，主要存在于双子叶植物和拟南芥等非禾本科单子叶植物中，涉及铁螯合还原酶2（FRO2）将Fe3+还原为Fe2+，随后由铁调节转运蛋白1（IRT1）跨质膜运输Fe2+。该策略由质膜H+-ATPase驱动的根际酸化以及铁螯合剂（如香豆素）支持。策略II，主要由禾本科植物如水稻采用，涉及分泌植物铁载体（PSs）如2'-脱氧麦根酸（DMA）来螯合土壤中的Fe3+，形成Fe3+-PS复合物，再通过黄色条纹样（YSL）寡肽家族的膜转运蛋白吸收。
铁稳态的转录调控网络复杂。在拟南芥中，bHLH转录因子POPEYE（PYE）和FER样铁缺乏诱导型转录因子（FIT）调控不同的基因亚群，共同参与铁的吸收和细胞稳态。FIT通过与Ib亚族bHLH蛋白（bHLH38、bHLH39、bHLH100、bHLH101）形成异源二聚体来调节其转录活性。这些Ib亚族bHLH蛋白的上游，bHLH IVc亚组的一些成员（包括bHLH34、bHLH104、bHLH105、bHLH115）作为正调控因子，直接控制bHLH38/39/100/101的表达。与之不同，采用策略II的水稻，其核心调控因子OsIRO2是拟南芥Ib亚族bHLH蛋白的同源物，特异性调控Fe3+-PS转运蛋白OsYSL15的表达。
小肽（通常少于100个氨基酸）是介导关键生理过程（如植物形态发生、器官发生和非生物胁迫适应）的关键调控因子。IRON MAN（IMA）多肽是近年来在高等植物中发现的一类新兴生物活性多肽，协调根际铁获取和细胞稳态。IMA多肽家族具有一个保守的17个氨基酸的C端基序，在缺铁条件下，拟南芥中的IMA多肽与BRUTUS（BTS）蛋白相互作用，稳定bHLH105/bHLH115，从而通过FIT、bHLHb和PYE调控缺铁响应基因的表达。IMA多肽还在维持铜（Cu）稳态和增强植物对镉（Cd）等重金属的耐受性中发挥作用。然而，IMA多肽在苹果铁稳态调控中的作用尚不清楚。
材料与方法
本研究使用了‘嘎拉’苹果（Malus domestica）的根、茎、叶、花等组织，以及‘茶海棠’（Malus hupehensis Rehd.）幼苗进行缺铁处理实验。模式植物拟南芥（‘哥伦比亚’生态型，Col）和番茄（‘Micro-Tom’品种）用于异源转化。‘王林’苹果愈伤组织用于内源功能验证。
通过生物信息学分析，对来自21个物种的IMA蛋白序列构建了系统发育树，并分析了苹果MdIMAs基因家族的结构、保守基序和序列。通过农杆菌介导的遗传转化方法，构建了MdIMA1过表达（MdIMA1-OE）的拟南芥、番茄转基因株系以及苹果愈伤组织，并构建了MdIMA1-RNAi苹果愈伤组织。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了基因表达模式。通过测量鲜重、根长、叶绿素含量、质膜H+-ATPase活性、铁螯合还原酶（FCR）活性和铁浓度等生理指标，评估了植物对缺铁的耐受性。根际酸化实验通过溴甲酚紫染色法进行。
结果
MdIMAs基因家族的系统发育与表达分析
系统发育树将IMA蛋白分为三个亚组。MdIMA1、MdIMA2和MdIMA3聚类在第3组，其中MdIMA1与杏（Prunus armeniaca）的KAH0970404.1亲缘关系最近。MdIMA4和拟南芥AtIMA则聚类在第2组。基因结构分析显示，MdIMA1、MdIMA3和MdIMA4均无内含子，而MdIMA2包含三个外显子和两个内含子。保守基序和序列比对分析表明MdIMAs具有高度的序列保守性。
组织特异性表达分析显示，四个MdIMAs基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉、种子和子房中均有表达。其中，MdIMA1在叶片中表达最高，而MdIMA2和MdIMA3在子房中表达最高。在缺铁处理下，苹果幼苗中MdIMA1的转录水平先升高后降低，而MdIMA2和MdIMA3的表达则下降，表明MdIMA1对缺铁胁迫更为敏感。
MdIMA1在拟南芥中的异源表达增强缺铁耐受性
构建了三个独立的MdIMA1-OE拟南芥株系。在正常供铁条件下，野生型（Col）与转基因株系在鲜重、主根长和叶绿素含量上无显著差异。然而，在缺铁条件下，Col幼苗表现出明显的失绿表型，鲜重、主根长和叶绿素含量显著降低，而MdIMA1-OE株系则显著优于Col。缺铁条件下，MdIMA1-OE植株的根际酸化（溴甲酚紫染色变黄区域更明显）和质膜H+-ATPase活性均显著强于Col。
对生长37天的植株进一步分析发现，缺铁条件下，MdIMA1-OE拟南芥的鲜重、叶绿素含量、FCR活性和铁浓度均显著高于Col。qRT-PCR分析表明，缺铁胁迫强烈诱导了H+-ATPase基因AtHA7的表达。此外，与铁吸收和转运相关的基因AtFRO2、AtIRT1、AtYSL3和AtFRO3在MdIMA1-OE拟南芥中的表达也显著上调。然而，与其它铁转运途径相关的AtNRAMP1和AtNAS1基因表达未受显著影响。这些结果表明，异源表达MdIMA1通过调节拟南芥中铁稳态关键基因的转录，增强了其缺铁耐受性。
MdIMA1在番茄中的异源表达增强缺铁耐受性
在番茄中异源表达MdIMA1也产生了类似效果。在缺铁条件下，MdIMA1-OE番茄株系的茎鲜重、根鲜重、株高、叶绿素含量、铁浓度、果实产量以及果实总铁含量均显著高于野生型番茄，而茎粗无显著变化。这进一步证实了MdIMA1作为铁稳态正调控因子的功能在不同物种间具有保守性。
MdIMA1调控苹果愈伤组织的缺铁耐受性
在苹果愈伤组织中过表达MdIMA1，显著增强了缺铁条件下的质子外排（培养基颜色由紫变黄更明显）和H+-ATPase活性，并积累了更多的铁。相反，利用RNAi技术沉默MdIMA1后，愈伤组织在缺铁条件下的H+-ATPase活性显著低于野生型。这些结果明确了MdIMA1在增强苹果自身应对缺铁胁迫能力中的关键内源作用。
讨论
本研究首次在苹果中鉴定了IMA多肽基因家族，并深入解析了MdIMA1的功能。系统发育和序列分析表明MdIMAs在进化上高度保守。表达分析提示MdIMA1可能在苹果的缺铁响应中扮演核心角色。
异源和同源遗传转化实验一致证明，MdIMA1的过表达能显著提高拟南芥、番茄和苹果愈伤组织对缺铁胁迫的耐受性。其作用机制涉及多个层面：
- 1.
促进根际酸化：通过上调质膜H+-ATPase（如AtHA7）的活性，增加质子分泌，降低根际pH，从而提高土壤中铁（特别是Fe3+）的溶解度。
- 2.
增强铁还原能力：提高FCR活性，将根际的Fe3+有效还原为可被植物吸收的Fe2+。
- 3.
上调铁吸收与转运系统：激活铁吸收关键基因如AtFRO2、AtIRT1，以及铁转运基因如AtYSL3、AtFRO3的表达，形成从还原、吸收到转运的协同增强效应。
- 4.
改善生长与光合生理：最终体现为转基因植株在缺铁条件下能维持更高的叶绿素含量、生物量（鲜重）、根长以及作物产量和果实铁含量。
本研究的结果与双子叶植物应对缺铁的“策略I”机制高度吻合。MdIMA1位于铁信号调控网络的上游，其功能与拟南芥中的IMA多肽类似，通过干预BTS与bHLH IVc转录因子的互作来稳定铁吸收的正调控因子，从而放大缺铁响应信号。值得注意的是，异源表达MdIMA1并未显著改变受体植物（拟南芥、番茄）内源IMA同源基因的表达水平，这反映了植物铁代谢网络的稳健性和基因功能冗余，也说明MdIMA1通过其保守的功能域整合并增强了既有的调控通路。
结论
综上所述，本研究鉴定并功能表征了苹果铁稳态调控的关键基因MdIMA1。MdIMA1在缺铁胁迫下被诱导表达，其过表达能通过激活根际酸化、增强铁螯合还原酶（FCR）和质膜H+-ATPase的活性，并上调一系列铁吸收与转运相关基因的表达，从而显著增强拟南芥、番茄和苹果愈伤组织对缺铁胁迫的耐受性，促进铁的吸收与利用，最终改善植物的生长和营养状况（如果实铁含量）。该研究不仅揭示了苹果铁营养调控的新机制，也为利用分子育种或基因工程手段改良苹果及其他作物的铁营养效率、培育耐缺铁和富铁品种提供了有价值的靶基因和理论依据。未来研究可进一步探索MdIMA1与其他矿质元素（如锌、锰）吸收的互作，以及其在田间复杂环境下的应用潜力。
