《SCIENCE ADVANCES》：Sleep deprivation impairs follicular development attributable to granulosa cell pyroptosis mediated by S100A8/A9-driven macrophage M1 polarization
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睡眠障碍是女性生殖健康的潜在威胁，但具体机制不清。本文研究发现，睡眠剥夺会通过上调S100A8/A9，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，诱导巨噬细胞M1极化，进而导致卵巢颗粒细胞焦亡，最终损害卵泡发育和胚胎质量。该研究揭示了睡眠不足影响生育的免疫机制，为相关人群的生育力保存提供了潜在策略。
随着现代生活节奏的加快，睡眠时间被不断挤压。大约有三分之一的成年人每天睡眠不足6小时，睡眠剥夺已成为一个重大的公共卫生问题。越来越多的证据表明，睡眠在维持生殖健康中扮演着至关重要的角色。临床研究发现，睡眠障碍与女性生育力下降有关，包括获卵数减少、激素水平紊乱以及妊娠成功率降低。尤其是在接受体外受精治疗的患者中，睡眠障碍更为普遍，并可能影响治疗结局。然而，睡眠剥夺究竟是如何“伤害”卵巢功能的，其背后的生物学机制一直笼罩在迷雾之中。
我们知道，睡眠剥夺会通过多种途径改变炎症免疫过程。卵巢拥有一个独特的免疫微环境，其中巨噬细胞是主要的免疫细胞群体。促炎的M1型与抗炎的M2型巨噬细胞之间的平衡对维持卵巢稳态至关重要。这种平衡的破坏与卵巢衰老、多囊卵巢综合征等多种病理状况相关。与此同时，一种被称为细胞焦亡的程序性炎性细胞死亡方式，也是免疫介导的卵巢功能障碍中的关键角色。颗粒细胞作为卵泡内最主要的体细胞，通过细胞间隙连接与卵母细胞“对话”，为其输送营养，支持其生长成熟。如果颗粒细胞出了问题，卵泡发育自然会受阻。那么，睡眠剥夺是否会打破卵巢内的免疫平衡，引发炎症风暴，并最终导致颗粒细胞焦亡呢？为了解开这个谜团，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了一项研究。
研究者们采用了多种关键技术来探索这一问题。他们使用了一种成熟的“防卷曲加水法”小鼠模型，成功实现了持续48小时的睡眠剥夺。为了评估睡眠剥夺对卵巢功能的多层次影响，研究综合运用了组织形态学分析（如H&E和Masson染色）、超微结构观察（透射电镜）、流式细胞术（用于检测细胞死亡、免疫细胞分群、活性氧和线粒体膜电位等）、酶联免疫吸附试验和炎症因子芯片检测。在分子机制层面，研究通过卵巢组织的转录组测序和10X单细胞转录组测序，全面描绘了睡眠剥夺后的基因表达变化和细胞异质性，并利用生物信息学分析进行通路富集和细胞互作推断。关键信号通路和细胞表型的验证则依赖于蛋白质印迹、免疫荧光染色和定量PCR技术。此外，研究还通过体内给药（使用抗炎药对乙酰氨基酚和S100A8/A9抑制剂Paquinimod）和体外Transwell共培养体系（共培养巨噬细胞与颗粒细胞），进一步明确了S100A8/A9及其下游通路的因果关系。
SD损害小鼠卵泡发育
研究人员首先发现，睡眠剥夺显著扰乱了小鼠的动情周期。对卵巢组织的分析显示，与对照组相比，睡眠剥夺组小鼠的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数量均显著减少，而闭锁卵泡数量增加，卵巢组织还出现了明显的纤维化（胶原纤维增多）。在超数排卵后，睡眠剥夺组小鼠的获卵数、卵母细胞成熟率显著降低，而卵子碎片率升高。这些结果直接表明，睡眠剥夺损害了卵泡的正常发育和卵母细胞的产出。
SD降低卵母细胞质量和胚胎发育潜能
进一步的评估发现，睡眠剥夺导致卵母细胞纺锤体结构异常、DNA损伤（γ-H2AX信号增强）的比例显著增加。透射电镜观察揭示，睡眠剥夺组的卵母细胞微绒毛减少，线粒体异常；颗粒细胞则出现细胞膜破裂、内容物外排等典型的焦亡样形态改变。体外受精实验表明，睡眠剥夺组的受精率、2-细胞胚胎形成率和囊胚形成率均显著下降。这些发现综合说明，睡眠剥夺不仅损害了卵母细胞本身的质量，也严重削弱了其支持早期胚胎发育的潜力。
SD诱导全身性炎症和中性粒细胞增多
为了探究背后的机制，研究人员检测了全身炎症状态。结果显示，睡眠剥夺48小时后，小鼠外周血中大多数促炎细胞因子显著升高，其中白细胞介素-6和白细胞介素-17A的增幅最为明显。血常规和流式细胞术分析均证实，睡眠剥夺组小鼠外周血中的中性粒细胞比例显著增加，而淋巴细胞比例下降，呈现出典型的急性炎症反应特征。使用抗炎药对乙酰氨基酚处理，可以有效缓解这些炎症指标。
SD导致卵巢组织炎性损伤
对卵巢组织的深入分析发现，睡眠剥夺引发了卵巢局部的炎性损伤和氧化应激。免疫荧光显示颗粒细胞DNA损伤增加；流式细胞术检测到线粒体膜电位下降、活性氧水平升高；生化检测表明氧化应激标志物丙二醛增加，而腺苷三磷酸、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平下降。同样，对乙酰氨基酚治疗能够显著减轻这些损伤，并改善睡眠剥夺小鼠的获卵数和胚胎发育结局。
SD诱导卵巢组织发生焦亡
通过Annexin V/PI流式检测，发现睡眠剥夺组卵巢组织中发生焦亡或坏死的细胞比例显著增加。免疫荧光和蛋白质印迹实验进一步证实，焦亡的关键执行蛋白Gasdermin D、以及NLRP3炎症小体相关蛋白（Caspase-1、IL-1β、IL-18）的表达在睡眠剥夺组卵巢组织中均显著上调。这从分子水平证实睡眠剥夺诱导了卵巢组织，特别是颗粒细胞的焦亡。
卵巢组织单细胞转录组分析
为了在单细胞精度上解析睡眠剥夺的影响，研究者对卵巢组织进行了单细胞转录组测序。分析确认了颗粒细胞、间皮细胞、免疫细胞等主要细胞类型。焦亡相关基因集评分显示，在睡眠剥夺后，颗粒细胞、免疫细胞和间皮细胞的焦亡相关基因表达显著升高。特别值得注意的是，中性粒细胞相关基因S100a8和S100a9的表达在睡眠剥夺组卵巢免疫细胞（主要是中性粒细胞）中显著上调。酶联免疫吸附试验也证实，小鼠外周血和卵巢组织中S100A8/A9蛋白水平升高。此外，生物信息学分析提示巨噬细胞向M1型极化，且中性粒细胞与巨噬细胞之间的通讯最强。这些线索串联起来，指向一个假说：睡眠剥夺促使中性粒细胞释放S100A8/A9，进而诱导巨噬细胞M1极化，最终导致颗粒细胞焦亡。
抑制S100A8/A9可缓解SD诱导的卵巢损伤
为了验证这一假说，研究者在睡眠剥夺期间使用了S100A8/A9抑制剂Paquinimod。结果表明，抑制S100A8/A9能够有效降低卵巢组织中S100A8/A9的表达，并减少巨噬细胞M1极化标志物CD86以及促炎因子IL-1β、TNF-α的水平。同时，Paquinimod处理还抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路（S100A8/A9的下游通路）的激活，并降低了焦亡相关蛋白（NLRP3, Caspase-1, GSDMD-N等）的表达。功能上，Paquinimod显著改善了睡眠剥夺小鼠的获卵数、卵母细胞成熟率及胚胎发育指标。这些体内实验证明，阻断S100A8/A9可以缓解睡眠剥夺引起的卵巢炎症和颗粒细胞焦亡。
抑制S100A8/A9在体外减轻巨噬细胞M1极化和颗粒细胞焦亡
体外Transwell共培养实验提供了更直接的证据。用S100A8/A9重组蛋白刺激巨噬细胞，可诱导其向M1型极化，并上调TLR4/MyD88/NF-κB通路；而Paquinimod处理能逆转这些效应。更重要的是，将经S100A8/A9刺激的巨噬细胞与颗粒细胞共培养后，颗粒细胞中GSDMD等焦亡标志物表达显著升高；而使用Paquinimod或与未受刺激的巨噬细胞共培养，则能减轻颗粒细胞的焦亡。这表明S100A8/A9主要通过极化巨噬细胞来间接加剧颗粒细胞焦亡。
综上所述，本研究系统阐明了睡眠剥夺损害女性生殖健康的完整链条。研究者发现，睡眠剥夺会引发强烈的全身和卵巢局部炎症反应，其特征是中性粒细胞浸润和S100A8/A9的大量释放。释放的S100A8/A9作为Toll样受体4的内源性配体，激活巨噬细胞表面的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，驱动巨噬细胞向促炎的M1型极化。M1型巨噬细胞进一步加剧卵巢炎症微环境，并可能通过激活NLRP3炎症小体，诱导颗粒细胞发生焦亡。颗粒细胞的大量死亡直接破坏了卵泡结构和支持功能，最终导致卵泡发育障碍、卵母细胞质量下降及胚胎发育潜能受损。该研究首次将睡眠剥夺、中性粒细胞/巨噬细胞驱动的先天免疫反应、颗粒细胞焦亡与卵巢功能衰竭有机地联系起来，揭示了睡眠影响生育力的一个先前未知的免疫学机制。这一发现不仅加深了对“睡眠-免疫-生殖”轴相互作用的理解，也为临床上因职业昼夜节律紊乱或睡眠障碍导致生育力下降的个体，提供了潜在的治疗靶点（如S100A8/A9或TLR4/NF-κB通路），为开发生育力保护策略奠定了科学基础。
