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本研究为堆肥厕所（Clivus Multrum）系统产生的渗滤液（leachate）作为液体肥料的首次评估之一。研究发现，该渗滤液含有中等水平的植物可利用养分，pH值近中性，且不支持大肠杆菌存活。温室试验表明，其在促进番茄和大麻生长方面与蚯蚓堆肥（vermicompost）和合成肥料效果相当，且未对根系微生物组产生非目标性影响。田间应用能提高干草产量和钾（K）含量而不影响饲料品质。这些发现证明了Clivus渗滤液作为传统肥料可持续替代品的潜力。
引言：传统废水管理的挑战与可持续替代方案
全球约有34亿人无法获得安全管理卫生设施，每年导致约140万人死亡。在高收入国家，虽然集中式污水处理系统和水处理技术大幅减少了水媒和卫生相关疾病，但这些方法存在显著缺陷，包括无法去除废水中的许多合成化学物质，如全氟和多氟烷基物质（PFAS）等。此外，处理厂在暴雨或机械故障期间会例行排放未经处理的废水，每年约有4.5万亿升未经处理的污水流入美国水体。这导致营养物质和相关污染物进入水道，使水质恶化，并造成人类健康风险。与此同时，污水处理也是温室气体排放的重要来源，并消耗大量资源。因此，堆肥厕所等卫生技术提供了有前景的解决方案。
由马萨诸塞州公司Clivus Multrum制造的堆肥厕所系统，提供了一种可持续的传统废水管理替代方案。与化粪池或集中式下水道不同，Clivus Multrum系统可以在有水或无水、有电或无电的情况下运行。其设计将卫生纸、排泄物与木屑等碳源结合，经过数年时间降解。一个假底位于储罐底部，允许多余的渗滤液排出并收集在一个独立的隔间，从而产生一种营养丰富的液体（渗滤液）和一个固体部分（“堆肥”）。
使用Clivus Multrum厕所产生的渗滤液可以转变对传统肥料的依赖，并有助于闭合养分循环。然而，美国联邦立法禁止将人类排泄物用于农业目的，除非获得州政府特别许可。这一法律障碍限制了对人类排泄物作为植物可利用养分来源的科学评估，并造成了关于使用Clivus渗滤液作为肥料时其农艺和微生物影响的知识空白。
相比之下，污水污泥和生物固体是废水处理厂的固体副产品，处理来自工业和住宅来源的混合废物流。虽然营养丰富，但已知生物固体和污泥含有重金属、药物和环境污染物，如微塑料和PFAS物质。研究表明，当它们被施用于农田时，会对土壤健康、水质和食品安全产生不利影响。作为回应，美国已有两个州和几个县颁布了在农业中使用这些材料的禁令。此外，佛蒙特州的Rich Earth Institute等团体正在探索源头分离卫生系统，如尿液分流，作为一种主动策略，从源头回收养分并防止工业副产品的污染。
与仅收集和处理人类排泄物液体部分的尿液分流系统不同，Clivus Multrum厕所通过在倾斜的储存罐中将排泄物、卫生纸和富碳填充剂结合，共同堆肥液体和固体废物。常见的填充剂在温带地区是松木刨花，在热带地区是椰子壳纤维/海藻。倾斜的设计允许尿液渗透通过堆肥物质，然后被收集在单独的隔间中。当尿液通过料堆时，尿素被转化为铵，铵可能通过土著微生物发生硝化作用转化为硝酸盐。尽管Clivus系统达不到嗜热温度，但较长的停留时间、稳定的曝气和高微生物多样性有助于养分稳定和病原体减少。此外，缺少嗜热步骤可能有助于保存有益的微生物，如植物促生菌（PGPR）。尽管其作为可持续肥料的潜力，但围绕排泄物改良剂的法规限制了科学评估Clivus渗滤液对土壤、作物和微生物群落的影响。本研究通过评估Clivus渗滤液的代谢和化学特性，并检验其在农业环境中应用时的农艺和微生物影响，来解决这些知识空白。
方法
目标1. 表征Clivus渗滤液的化学和代谢特性
渗滤液样品于2022年10月从三个州（VT, NY, MA）的Clivus Multrum系统中收集，共选择了11个厕所。在每个地点，从每个厕所的收集池中采集约1升渗滤液样品，密封在密闭容器中并于4°C储存。对每个渗滤液样品进行了一系列分析以表征其化学性质，包括使用pH计测量酸度，使用电导率仪测量电导率以评估盐度。通过氯化钾（KCl）提取硝酸盐和铵，并使用流动注射分析系统进行定量。其他养分在pH 4.8的乙酸铵（改良摩根溶液）中以1:5（体积比）提取15分钟。磷通过比色流动注射分析测定，其他养分通过电感耦合等离子体发射光谱法测量。
来自两个维护方法不同的Clivus厕所的渗滤液样品，被比较微生物活性和代谢多样性。一个样品来自Churchtown Dairy，代表一个高使用率的公共设施；另一个来自一个向储罐添加适量食物残渣的住宅地点。使用EcoPlates测量渗滤液样品中的微生物活性和代谢多样性。每个板包含一组不含碳的对照和31种碳源。将样品移入孔中，在25°C黑暗环境中培养6天，并使用微孔板分光光度计读取590 nm处的光密度。计算平均代谢响应和群落代谢多样性。
大肠杆菌存活
将Clivus渗滤液样品用作培养基，作为大肠杆菌存活的通用测试。制备松木刨花提取物作为对照。将三重抗利福平大肠杆菌菌株混合物添加到从佛蒙特州各厕所收集的Clivus渗滤液样品中。将样品在35°C下摇动，并在接种后0、5、20、29、48、98、120和168小时通过涂布平板法计数。通过线性混合效应模型分析存活率。
目标2. 对番茄和大麻植物生长和养分含量的影响
在连续两个实验中评估了Clivus渗滤液作为肥料和可能的天然生物刺激剂促进植物生长的能力。这些实验使用的渗滤液来自一个地点。
实验1旨在量化施用三种不同剂量（56、112、168千克N/公顷）Clivus渗滤液施肥的番茄幼苗的生长情况，并与两种对照肥力类型（均施用112千克N/公顷）进行比较。一种对照是商业合成肥料，第二种对照是经过高温堆肥并在流通式蚯蚓箱中腐熟的蚯蚓堆肥。将两周大的番茄幼苗移栽到装有巴氏灭菌土壤的盆中。在种植前手动将蚯蚓堆肥混入土壤，其他处理在移栽后立即施用。液体肥料处理在第0天和第7天以半剂量施用。每周测量植物物候，直到第21天破坏性采样，以量化根冠比并收集根系微生物组样品。此外，从每株植物收集最新成熟的叶片样品以评估养分含量。
实验2重复了第一个实验，但使用纤维大麻种子直接播种到装有巴氏灭菌田间土壤的塑料盆中。种植一周后，将全剂量液体肥料处理浇入幼苗。在第0、5、10和15天记录株高和叶片数量，在第15天测量茎粗并进行破坏性采样和相同分析。使用单向方差分析（ANOVA）分析处理对每种植物物种生长的影响。
目标3. 肥料处理对番茄和大麻根系微生物组的影响
在生长试验的最后一天，从施用蚯蚓堆肥、合成养分和112千克N/公顷Clivus的植物中收集微生物组样品。根据空间梯度将微生物组样品细分为根际、根表和内根圈。对每个样品的细菌和真菌群落进行分析。通过PMA光解和DNA提取处理样品，然后对细菌和古菌的16S rRNA基因V4区以及真菌的ITS1间隔区进行扩增子测序。使用DADA2流程进行序列质量控制并聚类为扩增子序列变异。使用贝叶斯分类器针对参考数据库分配分类。整合数据并进行群落组成差异检验。
目标4. 大规模施用对饲料质量和生产力的影响
在2023年和2024年于Old Mud Creek Farm进行了田间试验，评估Clivus渗滤液施用对干草产量和饲料质量的影响。该干草地由冷季禾草组成。将渗滤液以三种不同氮素用量和两种不同施用方式（一次全量或分两次各50%）施用。每次收获时，评估干草产量、饲料养分和质量指标。采用双向方差分析（ANOVA）分析处理和施用方式对每次收获的干草产量和饲料质量的影响。
结果
目标1. Clivus渗滤液的化学和代谢特性表征
渗滤液pH值适合植物生长（范围：6.4–7.5）。电导率在样品间存在差异，并且是氮含量的良好预测指标。氮主要以铵的形式存在。来自住宅地产的渗滤液样品平均代谢多样性比Churchtown Dairy的样品高60%。两个样品都显示出与氨基酸和复杂碳水化合物降解相关的代谢活动。Churchtown Dairy渗滤液的代谢谱更专门化，而住宅渗滤液显示出更广泛的代谢能力，这可能反映了食物垃圾的添加。
大肠杆菌存活
渗滤液样品不支持大肠杆菌混合物的存活。在所有样品中，接种后大肠杆菌种群迅速下降，松木刨花对照在24小时后未检测到细胞，所有渗滤液样品在168小时后完全死亡。与渗滤液相比，填充剂提取物在所有时间点的大肠杆菌存活率都较低，证实单独的填充剂提取物无法维持细菌。三种渗滤液来源之间的大肠杆菌存活率相似。总体而言，这些结果表明本研究中分析的Clivus渗滤液样品不提供有利于大肠杆菌存活的条件。
目标2. 对植物生长和养分含量的影响
对于施用Clivus渗滤液和对照组的植物，大多数生长指标在番茄和大麻中相似。处理对株高、茎粗、根冠比、叶片和花朵数量以及叶片养分的影响在两种植物物种中都很小，但在番茄植物中检测到细微差异。
植物物候：番茄和大麻的株高和叶片数量在所有处理间随时间变化相似。番茄花朵数量在第21天一般随着Clivus渗滤液施氮量的增加而下降，但处理间花朵数量的差异很小。施用合成肥料的番茄植株茎粗比用蚯蚓堆肥或Clivus渗滤液生长的植株粗约20%。大麻植株的茎粗不因处理而异。施用56千克N/公顷Clivus渗滤液的番茄植株的根冠比值大于施用合成肥料的植株。这种效应在大麻植株中未观察到。
叶片养分：施用112或168千克N/公顷Clivus渗滤液的番茄植株，其叶片氮和磷含量相似，但钾含量高于用合成肥料生长的植株。这种效应在大麻植株中未观察到。用蚯蚓堆肥施肥的番茄植株钙含量最高。用Clivus渗滤液或蚯蚓堆肥生长的植株，其钠含量高于用合成肥料生长的植株。与对照组相比，用Clivus渗滤液处理的大麻和番茄植株的锰含量更高，并且通常随着渗滤液施氮量的增加而增加。施用Clivus或合成肥料的番茄植株叶片锌浓度高于在蚯蚓堆肥中生长的植株。所有其他微量养分和重金属在处理间相似。
目标3. 肥料处理对番茄和大麻根系微生物组的影响
施用Clivus渗滤液并未显著改变两种植物的微生物组组成。Clivus在植物生长和根系微生物组影响方面与合成肥料处理最为相似，但总体上处理和微生物生境间的差异很小。
细菌群落组成：总体上，处理间群落组成的最大变异发生在根际，并随着接近根部而减小。Clivus产生的微生物群落与合成肥料最为相似，尽管处理对细菌组成的影响对两种植物物种都相对较小。
在根际，Clivus和合成肥料处理中的细菌群落无法区分，但与两种植物物种中的蚯蚓堆肥不同。番茄根表群落在所有处理间都有差异，而在大麻中，只有Clivus和蚯蚓堆肥不同。在内根圈，大麻中蚯蚓堆肥群落与Clivus和合成处理都不同。相比之下，番茄内根圈在Clivus和合成处理间有差异，但两者都与蚯蚓堆肥相似。
放线菌、芽孢杆菌、浮霉菌、α-和γ-变形菌、疣微菌和拟杆菌是番茄和大麻植物各微生物生境中的主要分类类别。通常，芽孢杆菌、浮霉菌和疣微菌的相对丰度从内根圈到根际增加。γ-变形菌和拟杆菌则相反。α-变形菌和放线菌没有一致的空间模式。
Clivus和合成肥料支持相似的微生物群落，特别是在根际相对于蚯蚓堆肥。在番茄中，与蚯蚓堆肥相比，Clivus和合成处理增加了细菌类别芽孢杆菌、嗜热油菌和放线菌的丰度。相反，与Clivus相比，噬纤维菌和Vicinamibacteria在蚯蚓堆肥下富集。在番茄根表，蚯蚓堆肥和合成处理下的拟杆菌比Clivus更丰富，而内根圈没有差异丰富的类群。
在大麻根际，在Clivus和合成肥料处理下观察到相似的微生物群落，而芽孢杆菌和酸杆菌在蚯蚓堆肥处理中更丰富。在大麻根表或内根圈群落中未观察到差异类群。
真菌群落组成：用Clivus生长的植物的真菌群落与合成肥料处理相当，而蚯蚓堆肥则更为独特。具体而言，合成肥料组的根际群落与大麻植物的蚯蚓堆肥不同，番茄也是如此。Clivus处理的ITS群落与两种植物根际的蚯蚓堆肥都不同。然而，在根表和内根圈微生物生境中，没有检测到处理和植物类型之间的差异。
子囊菌、担子菌和被孢霉主导了番茄和大麻所有根区的真菌群落。子囊菌包括丰富的科，如曲霉科、毛壳菌科、麦角菌科、肉座菌科和丛赤壳科。曲霉科通常在Clivus和合成肥料处理的根际和根表中富集。毛壳菌科、麦角菌科、肉座菌科和丛赤壳科在Clivus和合成处理下的内部根区也更普遍。只有被孢霉科存在差异丰富，在蚯蚓堆肥和Clivus处理的番茄和大麻植物的根际中富集，与合成肥料相比。没有其他类群显示出处理差异。
目标4. 田间规模施用对饲料生产力的影响
与未改良地块相比，增加Clivus渗滤液的施氮量提高了干草产量和钾含量。由于收获前生长期较长，第二次收获的产量高于第一次收获；然而，处理效应遵循相似的模式。氮素施用量是对饲料质量和产量影响的主要驱动因素，而施用方式没有显著影响。
收获1：与未施肥对照地块相比，施用中等和高氮量Clivus渗滤液的地块干草产量更高。具体而言，以分次增量施用高剂量的地块产量高于对照，而一次全量施用则没有这种效果。对于接受中等剂量渗滤液的地块，一次全量施用比对照产量更高，而分次施用没有显示差异。总之，较高的施氮量总体上提高了产量，而施用时间（一次 vs. 分次施用）的影响不太一致。干草的钾含量与Clivus渗滤液提供的施氮量呈正相关，并且在施用全量或分次90千克N/公顷的地块中高于未改良对照地块。所有其他养分在处理间相似。此外，处理间在粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、非纤维碳水化合物、相对饲用价值或总可消化养分方面未检测到主要差异。
收获2：更高的施氮量与更高的干草产量相关。例如，施用高剂量渗滤液比对照地块产生更高的干草产量。没有发现显著的成对处理组合。对于接受高剂量的地块，无论渗滤液是一次还是分次施用，产量都相同。同样，对于中等剂量，
