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本研究通过泛基因组框架结合代谢通路预测，对1498株法国临床分离株(包括370株成人共生菌株和1128株引起严重感染的肠外致病性大肠杆菌)进行了深入分析。核心发现是代谢谱主要受系统发育影响，未发现与生活方式(共生或致病)特异相关的通路。然而，研究鉴定出多个与主要全球流行克隆(如STc131、STc14)特异性相关的代谢能力(如D-阿皮糖降解通路)，这些能力可能通过利用特定营养物质支持肠道定植和肠外生存，从而促进其生态成功和全球传播。这项工作揭示了菌株谱系特异性代谢特征在解释主要ExPEC克隆成功中的关键作用，加深了对细菌适应性及感染机制的理解。
引言
新陈代谢是细菌适应营养环境的关键。大肠杆菌作为一种存在于哺乳动物肠道中的常见共生菌，同时也是重要的肠道内(IPEC)和肠道外(ExPEC)致病菌。基于“营养生态位”假说，细菌需要通过利用不同的底物来在其各种栖息地中生长和持续存在。大肠杆菌具有克隆种群结构，包含八个主要的系统发育群(phylogroups)，且系统发育群与生活方式(共生或致病)存在强关联。已有研究表明代谢谱与系统发育群的关系强于与致病型的关系，但识别与生活方式特异性相关的代谢特征仍具挑战性。本研究旨在利用一个大规模、特征明确的菌株集合，结合泛基因组分析和代谢通路预测，探索与生活方式和系统发育背景相关的代谢特征，特别是关注主导ExPEC克隆，以期识别可能促进某些克隆成功出现和感染潜力的代谢特性。
材料与方法
研究分析了来自法国、采集时间跨度为2000年至2017年的370株成人共生菌株和1128株肠外致病菌株的基因组。共生菌株来自健康志愿者粪便样本，致病菌株则来自血流感染(BSI)和呼吸机相关性肺炎患者。所有菌株均通过Illumina平台进行短读长测序。利用Pyrodigal等工具对基因组进行注释，并使用PPanGGOLiN构建泛基因组。通过将泛基因组家族序列比对MetaCyc和EcoCyc等数据库中的参考序列，建立了基因-蛋白-反应关联，进而通过Pathway Tools预测代谢通路。采用多元对应分析(MCA)和层次聚类分析代谢谱的差异，并通过比较通路在不同菌群中的频率来识别特异性通路。针对关键的D-阿皮糖降解通路，利用MicroScope平台、Clinker等工具进行了基因组特征分析，并通过在含有D-阿皮糖的M9基本培养基中的生长实验进行了功能验证。此外，还利用AllTheBacteria数据库进行了大规模的基因簇筛查。
结果
流行病学相关菌株集合及其与生活方式相关的种群遗传结构
本研究使用的1498个大肠杆菌基因组涵盖了八个主要的系统发育群。与共生菌株相比，多个系统发育群在不同感染来源的菌株中存在过代表征或欠表征现象。例如，系统发育群B2在所有来源(除消化道来源外)中都过代表，而系统发育群A在所有来源中都欠代表。与尿液来源菌株相比，共生菌株以及消化道来源和其他来源的菌株显示出更高的遗传多样性，尿液来源的菌株中高达69.15%的菌株属于前10个最常见的序列类型。这些结果表明，该数据集具有与生活方式相关的种群结构，适合进行代谢关联性研究。
高基因组及代谢多样性的菌株集合
分析显示，该菌株集合在基因家族、反应和代谢通路方面具有高度多样性。泛基因组是开放性的，而泛反应组和泛代谢通路库则相对闭合。核心反应和核心通路相较于核心基因更为保守。可变的通路主要涉及“生物合成”和“降解”过程，其中O-抗原生物合成通路是“生物合成”类别中可变通路的主要组成部分。
代谢多样性主要受系统发育驱动
分析不同来源和系统发育群的基因、反应和通路数量，发现排除尿液来源菌株后，通路数量与基因组数量之间的相关性变得显著，这表明尿液来源菌株的代谢和基因组多样性可能较低。多元对应分析表明，代谢多样性主要由系统发育驱动，而非菌株来源。代谢距离与基于核心基因的遗传距离之间存在显著正相关，进一步支持了代谢谱与系统发育背景的紧密联系。
少数通路区分引起BSI的系统发育群和主要序列类型复合体(STcs)
对出现频率在5%至95%之间的通路进行层次聚类分析，未发现基于菌株来源的明显区分，而聚类模式强烈反映了系统发育群分类，系统发育群B2尤其明显区别于其他类群。在更精细的分辨率上，与BSI相关的主要STcs显示出特定的代谢特征谱。研究发现，没有一个通路能够满足“在一个群体中出现频率>80%而在另一个群体中<20%”的条件来区分共生与致病性生活方式。然而，在比较系统发育群时，发现了34个通路在至少一个系统发育群中过代表或欠代表，其中除一个外均与降解过程相关。进一步分析发现，在主要STcs中，STc69(系统发育群D)相比于同系统发育群其他菌株，有三个特异性富集的通路：S-甲基-5'-硫代腺苷降解I、5'-脱氧腺苷降解II和甲醛氧化I。在系统发育群B2的主要ExPEC STcs(STc131, STc73, STc95, STc14)中，发现了13个通路存在特异性存在/缺失模式。值得注意的是，五个通路是STc131和STc14所共有的，且频率完全相同，这些通路都涉及D-阿皮糖降解，表明这两个克隆共享了这种特殊的分解代谢能力。这些谱系特异性的代谢能力，例如在STc69中鉴定出的通路可能支持肠外生存，而在B2系统发育群中，克隆特异性通路能够降解植物来源的化合物，可能通过利用定义生态位的营养物质促进肠道定植。
大肠杆菌属中D-阿皮糖降解通路的特征分析
D-阿皮糖降解通路被发现是STc131和STc14这两个近期大流行克隆核心的代谢特征。对完整基因组的筛查证实，该通路存在于100%的STc131和STc14菌株中，也存在于部分费格森埃希菌中。基因簇比较显示，大肠杆菌中的基因簇缺少D-阿皮糖异构酶基因(apsI)，但包含两个编码假定氧化还原酶的CDS，推测在功能上替代了apsI。在所有情况下，该基因簇都位于肠杆菌素生物合成基因的下游。对该基因簇的系统发育分析显示，与大肠杆菌系统发育群B2的核心基因系统发育高度一致，表明其在这些谱系中的获得是古老的。大规模的数据库筛查显示，该通路广泛存在于多种环境或植物相关细菌属中，但在埃希菌属中，其主要存在于STc131和STc14中。生长实验证实，携带该基因簇的菌株能以D-阿皮糖为唯一碳源生长，验证了其功能。综合来看，这些数据证明了D-阿皮糖降解通路在STc131和STc14中的特异性和功能性存在。在B2系统发育群内及主要STc131分支间观察到的强系统发育一致性，支持了该通路在B2菌群出现早期即被获得，随后在其他B2菌株中多次丢失的假说。此外，该通路在费格森埃希菌中的中间频率及侧翼核心基因的系统发育分析，暗示了可能存在通过种间同源重组发生的水平基因转移事件。
讨论
本研究通过分析特征明确的共生菌株和引起严重肠外感染的大肠杆菌菌株代谢通路，未发现严格与致病性或BSI入侵门户相关的特异性通路。核心发现是代谢谱主要受系统发育影响，这与该物种的克隆结构及系统发育背景与生活方式的紧密联系相一致。然而，研究发现了一些与主要BSI相关克隆特异性相关的代谢特征。在STc69中发现的S-甲基-5'-硫代腺苷降解I和5'-脱氧腺苷降解II等通路，可能有助于在尿液和血液等肠外环境中回收利用5'-脱氧核苷，支持ExPEC的生长。而在系统发育群B2的主要克隆中，多数特异性通路涉及植物来源化合物的降解，包括STc131中的3-(3-羟基苯基)丙酸降解、STc73中的果胶降解、STc14中的磺基喹诺糖基二酰基甘油降解以及STc131和STc14共有的D-阿皮糖降解。这些发现暗示此类通路可能为这些成功克隆提供生态优势。D-阿皮糖降解通路是植物细胞壁的关键成分，其功能在大肠杆菌中得到实验验证，其高度特异性的分布提示其可能为STc131和STc14在肠道生态位中提供独特的营养利用优势，从而可能促进其定植和传播。本研究的局限性包括数据集未涵盖大肠杆菌的全部多样性、基于基因组的通路预测可能存在偏差、无法评估转录或转录后水平的代谢变异，以及未考虑可能影响酶效率的等位基因变异。总之，研究揭示了大肠杆菌代谢中深刻的系统发育印记，并强调了谱系特异性代谢能力在主要ExPEC克隆的生态成功和全球传播中的潜在作用。
