《Bioactive Materials》：Sustained release PLGA microspheres loaded with a bone-affinity Bmp2 enhance fracture healing and mitigate heterotopic ossification
编辑推荐：
本研究旨在解决骨形态发生蛋白2（Bmp2）临床应用面临的体内稳定性差、半衰期短及诱发异位骨化风险高的问题。研究人员通过将Bmp2与骨亲和肽（DSS6）融合，并封装于多孔PLGA微球中，构建了D-Bmp2@M系统。该“缓释-分子锚定”协同策略使Bmp2在保留生物活性的同时获得了高骨组织亲和力，实现了长达约30天的稳定缓释，显著促进了骨质疏松性骨折愈合，并有效降低了异位骨化风险，为骨折治疗提供了新策略。
骨折，特别是像骨质疏松性骨折这类难以愈合的骨折，是临床上面临的一大挑战。常规手术效果有限，而一种被称为骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2， Bmp2）的、被美国FDA批准的骨生长因子，虽有强大促成骨潜力，但临床应用却“束手束脚”。这主要有两大“拦路虎”：其一，Bmp2个头小、半衰期短，在体内代谢快，难以维持骨折愈合所需的长效治疗浓度；其二，它缺乏组织特异性，容易从骨折部位“溜”到周围肌肉组织中，错误地诱导肌肉干细胞“转行”变成骨细胞，形成不该有的骨头，也就是“异位骨化”，发生率可高达约70.1%。现有的单一策略，无论是开发缓释系统延长作用时间，还是添加靶向分子增强骨组织富集，都无法同时解决空间（靶向）和时间（长效）这两个维度的难题。
为了解决这一瓶颈，来自首都医科大学附属北京世纪坛医院关节外科的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了一项创新研究，他们提出了一种“缓释-分子锚定”的协同策略，成功构建了一种新型的载药系统——D-Bmp2@M。该系统将Bmp2与一种骨亲和肽（由6个重复的Asp-Ser-Ser序列组成，即DSS6）融合，形成D-Bmp2，再将其封装到具有“自愈合”能力的多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic acid)， PLGA）微球中。这个精巧的设计旨在“一箭双雕”：一方面，通过PLGA微球的缓慢降解，实现D-Bmp2长达约30天的持续释放，匹配骨折愈合的关键时间窗；另一方面，利用DSS6肽对骨组织主要成分羟基磷灰石的高亲和力，将释放出的D-Bmp2“锚定”在骨折部位，减少其向周围软组织的扩散，从而在加速愈合的同时降低异位骨化风险。
为开展研究，作者运用了多项关键技术方法。首先，通过分子克隆和细胞（HEK293T）表达系统制备并纯化了Bmp2和D-Bmp2融合蛋白，利用圆二色光谱、Bmp2报告基因系统和细胞实验验证了其结构、生物活性及骨亲和力。其次，采用双乳化-自愈合技术制备了负载蛋白的多孔PLGA微球，通过扫描电镜、共聚焦显微镜、体外释放实验及生物活性检测，表征了其形貌、载药性能、长达30天的缓释特性及释放蛋白的活性保持。再次，建立了体外Transwell共培养模型（包括成骨细胞-骨模型和肌细胞-骨模型）来模拟评估系统的靶向促成骨和减少异位成骨分化的能力。最后，在动物水平，研究构建了小鼠股骨横断骨折模型和去卵巢（OVX）诱导的骨质疏松性骨折模型，通过局部注射不同制剂，综合运用X射线、Micro-CT三维重建、组织学染色（H&E、Masson）、免疫荧光组化等技术，在体评估了D-Bmp2@M对骨折愈合的促进效果、对异位骨化的抑制能力以及初步的生物安全性。
3.1. 理性设计的D-Bmp2保留了生物活性并增强了骨亲和力
研究人员通过蛋白质结构预测，将DSS6肽理性融合到Bmp2的N端，以避免影响其生物功能。实验证实，D-Bmp2在HEK293T细胞中成功表达和分泌，纯化后蛋白纯度≥98%。圆二色光谱显示其核心二级结构未受显著影响。Bmp2报告基因系统、qPCR和Western blot分析均表明，D-Bmp2激活Bmp/Smad信号通路、上调Runx2和Sp7等关键成骨转录因子表达的能力与Bmp2无显著差异，证明融合肽未损害其生物活性。更重要的是，羟基磷灰石结合ELISA、组织切片结合实验及离体股骨结合实验均一致证明，D-Bmp2对骨组织具有特异且显著增强的亲和力，而对肌肉组织无特殊亲和性。
3.2. 自愈合PLGA微球实现了生物活性D-Bmp2的体外持续释放
通过双乳化法制备多孔PLGA微球，经被动扩散载药后，在40°C下加热2小时诱导微球表面孔隙“愈合”，形成独特的“密闭独立腔室”结构。扫描电镜和共聚焦成像证实了D-Bmp2被成功封装于微球腔内。该载药微球可冻干成白色粉末，在4°C下储存6个月蛋白活性保持稳定。体外释放实验显示，载有Cy7标记D-Bmp2的微球在磷酸盐缓冲液中能持续释放约30天，释放曲线平缓。扫描电镜动态观察揭示了微球经历“表面孔开放—孔网络扩张—结构降解—最终塌陷”的四阶段降解模式，支持其长效释放能力。对收集的释放上清进行蛋白浓度和生物活性检测发现，释放出的D-Bmp2在整个30天内均保持生物活性，活性下降主要归因于浓度降低。
3.3. D-Bmp2@M的骨亲和力在体外促进成骨并减弱异位成骨分化
通过建立体外Transwell共培养模型进行功能验证。在成骨细胞-骨模型中，D-Bmp2@M在羟基磷灰石存在的情况下，凭借其缓释和骨亲和双重特性，显著增强了MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性、钙结节矿化以及Runx2和Sp7的基因表达。而在肌肉-骨模型中，D-Bmp2@M能特异性地富集在共培养的牛骨片上，从而显著降低了下方C2C12肌细胞中碱性磷酸酶活性及Runx2、Sp7的表达，证明了其减少异位成骨分化的潜力。
3.4. D-Bmp2@M在体内实现了具有骨靶向能力的持续释放
体内荧光成像显示，游离的Bmp2或D-Bmp2注射后信号快速扩散和清除，而PLGA微球封装能显著延长局部滞留时间，其中D-Bmp2@M组的信号维持时间最长（约27天）。注射后第1天和第6天的离体组织荧光成像及组织切片免疫荧光染色均证实，无论是游离形式还是从微球中释放出来，D-Bmp2相较于Bmp2都在骨组织边界显示出更强的特异性富集，骨-肌荧光强度比显著更高，体现了其优秀的体内骨靶向能力。
3.5. D-Bmp2@M促进骨折愈合并减少体内异位骨化
在小鼠股骨骨折模型中，局部单次注射D-Bmp2@M进行治疗。X射线和Micro-CT结果显示，D-Bmp2@M治疗组在术后28天产生了最大、最致密的骨痂，骨折愈合质量最佳。组织学染色（H&E和Masson）进一步证实了该组具有最大的骨痂面积和新骨形成面积。值得注意的是，Bmp2@M治疗组在骨痂周围观察到了异位骨化（发生率66.7%），而D-Bmp2@M组则未检测到，显著降低了这一不良反应。免疫荧光组化显示，D-Bmp2@M组骨痂中Runx2、Sp7和ALP的表达水平最高，表明Bmp2信号通路被有效激活。
3.6. D-Bmp2@M在体内表现出初步良好的安全性
对接受不同剂量D-Bmp2@M或游离D-Bmp2注射的小鼠进行安全性评价。主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的组织病理学检查未发现炎症、坏死或纤维化等病变。注射部位肌肉和股骨也未观察到明显病理改变。血液学分析和血清生化指标（肝功能ALT、AST，肾功能UREA、CREA）均在正常生理范围内，各组间无显著差异，表明D-Bmp2@M具有良好的体内安全性。
3.7. D-Bmp2@M促进骨质疏松性骨折愈合
在去卵巢诱导的骨质疏松小鼠骨折模型中，骨折愈合明显延迟。D-Bmp2@M治疗显著改善了这一状况，在术后14天即诱导了明显的骨痂形成。28天时，Micro-CT定量分析显示，D-Bmp2@M组骨痂的骨密度和骨体积分数显著高于PBS对照组，并恢复至接近正常骨折小鼠的愈合水平。组织学和免疫荧光组化分析一致表明，D-Bmp2@M治疗促进了骨质疏松性骨折的愈合，上调了骨痂中成骨相关标志物的表达，且未引发异位骨化。
研究结论与讨论：
本研究成功构建并验证了D-Bmp2@M这一集成“持续释放”与“骨靶向递送”的协同给药系统。该系统通过理性融合骨亲和肽DSS6，使Bmp2获得了显著的骨组织靶向能力，且不损害其生物活性；同时，利用独特的自愈合多孔PLGA微球，实现了D-Bmp2长达约30天的稳定、持续释放，释放的蛋白始终保持生物活性。这种时空双控的设计产生了协同效应：在多种骨折模型，尤其是难愈性的骨质疏松性骨折模型中，D-Bmp2@M单次给药即可显著加速骨折愈合，提高骨痂的质量和数量；更重要的是，其骨靶向特性有效限制了Bmp2向周围软组织的扩散，从而将Bmp2@M治疗组中高达66.7%的异位骨化发生率降低至零。初步的安全性评估显示该系统具有良好的生物相容性。
该研究的创新之处在于，它没有局限于单一的递送策略优化，而是通过巧妙的分子工程和剂型设计，同时攻克了Bmp2临床应用中的时空两大瓶颈。相较于释放周期短（约1周）的传统载体（如胶原海绵）或缺乏长效作用的单一靶向策略，D-Bmp2@M系统提供了与骨折愈合进程相匹配的长效治疗窗口，并通过主动靶向降低了因高剂量使用和脱靶扩散带来的异位骨化风险。其所用的PLGA材料是FDA已批准的可生物降解材料，DSS6肽是短链亲水序列，具有较好的临床转化潜力。这项工作为治疗骨折，特别是伴有愈合障碍的骨质疏松性骨折，提供了一种高效且安全的新策略，展现了显著的临床转化前景。未来的研究可在更大动物模型、长期安全性及免疫原性、以及与临床金标准载体的直接对比等方面进行深入探索。
