灵感自骨基质的仿生皮肤双层水凝胶：通过时空分治功能协同调控神经-免疫-血管促糖尿病创面愈合

《Bioactive Materials》：Bone matrix-inspired whitlockite porous ceramic with effects of autophagy activation contributes to bone regeneration

为了解决糖尿病创面愈合过程中神经-免疫交互失调和血管生成受损，且单一敷料难以实现时空精准调控的挑战，研究人员受天然皮肤双层结构的启发，设计了一种智能导电仿皮肤双层水凝胶。该水凝胶上层提供各向异性导电保护，下层实现响应性粘附与按需释药，能够时空协同地调控巨噬细胞极化、促进血管生成与神经再生，为糖尿病等慢性创面的分阶段精准修复提供了新策略。

　　

糖尿病，这个困扰全球数亿人的慢性疾病，其并发症之一的慢性创面愈合，一直是临床治疗中的巨大难题。高血糖状态不仅会损害神经功能，扰乱免疫系统的正常运作，还会导致血管新生困难，使得伤口容易感染、迁延不愈。传统的单一功能敷料，常常顾此失彼，难以应对愈合过程中不同阶段（如早期的抗炎和晚期的促再生）的复杂需求。这就像一个乐队缺少指挥，各个乐手（不同的修复细胞和因子）无法在正确的时间奏出和谐的乐章。那么，能否设计一种像智能皮肤一样的“创可贴”，既能感知伤口微环境的“指令”，又能“指挥”修复过程有序进行呢？近期发表在《Bioactive Materials》上的一项研究，给出了一个充满想象力的答案。

研究者们从皮肤的精巧结构中获得灵感。我们天然的皮肤分为致密坚韧的表皮层和富含细胞外基质的真皮层，分别承担着保护和再生的功能。模仿这一结构，研究团队成功开发了一种仿皮肤智能导电双层水凝胶。这项研究的核心在于，它不再是“一锅乱炖”，而是将功能“分而治之”：上层水凝胶模仿表皮，构建了各向异性的导电网络，既坚固耐用，又能高效传递电信号，并持续释放镁离子（Mg²⁺）；下层水凝胶模仿真皮，能紧密粘附伤口，并且“聪明”地感知伤口处过量的活性氧（ROS）和高葡萄糖环境，从而精准地按需释放一种关键的神经肽——降钙素基因相关肽（CGRP）。这种时空分治的设计理念，旨在像一位高明的导演，在伤口愈合这场“大戏”中，让不同的“演员”在正确的时间、正确的位置登场。

为了验证这一构想，研究人员运用了多项关键技术。在材料构建方面，通过“盐析-拉伸-退火”工艺构建了上层具有取向结构的聚乙烯醇（PVA）基导电水凝胶，并引入了聚(3,4-亚乙二氧基噻吩):聚(苯乙烯磺酸)（PEDOT:PSS）和纳米氧化镁（MgO）；通过合成含有季铵阳离子和动态硼酸酯键的功能聚合物（PEEP），与PVA复合制备了下层响应性粘附水凝胶。在生物学评价中，研究采用了糖尿病（DM）小鼠全层皮肤缺损模型进行在体功效验证。在机制探索层面，综合运用了包括转录组测序（RNA-seq）、基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析、蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色、流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）以及体外内皮细胞成管实验等一系列细胞与分子生物学技术，从多角度阐明了材料的促愈合机制。

2.1. 上层各向异性水凝胶的结构表征

通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、小角X射线散射（SAXS）、原子力显微镜（AFM）和激光共聚焦显微镜等多尺度表征证实，经过重构的上层水凝胶成功形成了稳定、取向的微观结构，功能组分（PEDOT:PSS和纳米MgO）均匀分布，这为高效的电荷传输和机械稳定性奠定了基础。

2.2. 上层水凝胶的功能性能

热力学、力学和电学测试表明，上层水凝胶（M@APC）具有优异的抗溶胀性、高韧性、良好的抗疲劳性能以及有效的电子传导能力，同时能持续释放Mg²⁺离子，集保护、导电和药物递送功能于一体。

2.3. 下层水凝胶的制备与功能评估

成功合成了含有季铵阳离子和动态硼酸酯键的聚合物PEEP，并制备了下层水凝胶（PP）。该水凝胶具有良好的湿态粘附性、ROS清除能力，并且其动态交联网络能响应糖尿病微环境（高葡萄糖和高ROS），实现加速降解和按需药物释放。

2.4. 双层水凝胶的抗菌活性与生物相容性

双层水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出接近100%的抑菌率，这得益于下层季铵盐的膜破坏作用和上层Mg²⁺释放及碱性的协同抗菌效果。细胞毒性、溶血及体内植入实验均证实该材料具有良好的生物相容性和生物安全性。

2.5. C@PP对RAW264.7细胞极化的体外调节

在糖尿病条件下，负载CGRP的下层水凝胶（C@PP）能有效抑制巨噬细胞向促炎M1表型（标志物CD86、iNOS、TLR4表达下调）极化，并促进其向促修复M2表型（标志物CD206、CD200R1表达上调）转化，表明C@PP结合了PP的ROS清除功能和CGRP的调节活性，具有强大的免疫调节作用。

2.6. 对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移的体外调节

Transwell和小室划痕实验表明，经C@PP调节后的巨噬细胞条件培养基能缓解糖尿病条件对内皮细胞迁移的抑制。单独添加Mg²⁺（来自上层水凝胶）或单独施加外源性电刺激（ES）能进一步促进迁移，而三者联合（DM-C@PP/M@APC-E）则产生最强的协同效应，使迁移细胞数约翻倍。同时，上层的取向结构能为细胞爬行提供接触引导，促进其定向伸展。

2.7. 协同治疗策略在体外促进血管生成

在基因、蛋白和功能形态水平上，协同治疗（DM-C@PP/M@APC-E）能最显著地上调血管生成相关基因（CD31、VEGF、HIF-1α）和蛋白的表达。Matrigel内皮细胞成管实验显示，该组能形成最完整、致密的毛细血管样网络，节点数、总长度和网状结构数量均显著优于其他组。

2.8. 转录组学分析揭示的血管生成生物学机制

转录组测序和富集分析表明，相较于仅用C@PP处理，联合Mg²⁺和电刺激（DM-C@PP/M@APC-E）能显著富集与细胞外基质组织、细胞连接组装、整合素结合等相关的通路。KEGG分析进一步揭示了肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路、细胞外基质-受体相互作用等关键通路被激活。这从分子层面证实了Mg²⁺与电刺激的协同作用能显著增强促血管生成潜力。

2.9. 仿皮肤双层水凝胶促进糖尿病创面愈合

在糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型中，与未处理组（DM）相比，所有水凝胶治疗组均加速了伤口闭合。其中，联合电刺激的DM-C@PP/M@APC-E组愈合最快，在第12天接近完全闭合。组织学（H&E和Masson染色）分析显示，该组炎症浸润最少，上皮化更完整，胶原沉积更规则、致密，表明其促进了真皮重建。

2.10. 仿皮肤双层水凝胶调控神经-免疫相互作用

免疫荧光分析显示，在术后第6天（炎症期），C@PP能有效抑制伤口中促炎M1型巨噬细胞（CD86⁺），并增加促修复M2型巨噬细胞（CD206⁺）。同时，DM-C@PP/M@APC-E组表现出最强的CGRP和神经生长相关蛋白43（GAP43）表达，表明该协同策略能有效促进早期神经肽释放和轴突发芽，加速神经重建。

2.11. 仿皮肤双层水凝胶促进血管生成

对血管标志物CD31和平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的双重免疫荧光染色显示，在术后第6天和第12天，DM-C@PP/M@APC-E组均表现出最高的CD31⁺新生血管密度和α-SMA⁺成熟血管覆盖率，且两者共定位增强。这表明协同治疗策略能显著促进糖尿病创面的血管新生、成熟和稳定化，为组织再生提供关键的代谢支持。

综上所述，本研究成功构建了一种模仿天然皮肤结构与功能的智能双层水凝胶敷料。它通过巧妙的时空分治设计：下层在早期响应高ROS/葡萄糖微环境，按需释放CGRP，精准调节巨噬细胞极化，扭转糖尿病创面的过度炎症状态；上层则在整个愈合期提供坚固保护、各向异性导电网络，并协同持续释放的Mg²⁺和外加电刺激，在免疫调节奠定的有利基础上，强力促进内皮细胞迁移、血管网络生成和成熟，并加速神经再生。转录组学分析从机制上揭示了电刺激与Mg²⁺在调控细胞外基质重塑、细胞连接和炎症相关通路中的协同核心作用。体内糖尿病创面模型证实，该双层水凝胶能显著加速伤口闭合，促进胶原有序沉积，并协同调控神经-免疫-血管三者互作，最终实现高质量的创面修复。

这项研究的重要意义在于，它超越了传统敷料“单一作用、全程通用”的局限，提出并验证了一种“结构仿生、功能时空协同”的慢性创面治疗新范式。它不仅为糖尿病等难愈性创面的分阶段精准修复提供了一种极具潜力的智能材料解决方案，其所蕴含的神经-免疫-血管协同调控策略，也为其他复杂组织再生领域（如心肌梗死、骨缺损）的智能生物材料设计提供了可借鉴的通用框架。