《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Quantitative Analysis of Ternary Complex Kinetics by a Surface Immobilization Method
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本研究建立了一种整合理论与实验的方法框架，用于可靠动力学表征靶向蛋白降解中的三元复合物。通过二聚体结合参数指导实验设计，结合预孵育策略和精确固定化策略，确保测量准确性。应用至CRBN/ARV-825/BRD4系统，发现强正协同效应（α=175），验证了该框架的有效性，为优化降解剂提供了系统方法。
夏欢梅|杨罗|方若欣|张海娜|米岚|马勇|朱向东|丁宇|费一岩
上海超精密光学制造工程研究中心，微纳光子结构重点实验室（教育部），复旦大学未来信息技术学院，中国上海200433
摘要
通过双功能分子实现目标蛋白降解是一种有前景的治疗策略，成功的降解需要高效的三元复合物形成。本研究通过结合理论建模和实验验证，建立了一个可靠的三元复合物动力学表征综合框架。我们证明了二元结合参数可以有效指导实验设计，而适当的组分固定以及使用校准浓度的预形成二元复合物可以确保测量的准确性。将这种方法应用于CRBN/ARV-825/BRD4系统，发现其具有强烈的正协同性（α = 175），这与卓越的降解效力相关。我们的方法为量化三元复合物动力学提供了一种系统的方法，并为通过动力学指导的设计提供了稳健的平台。
引言
目标蛋白降解（TPD）是一种新兴的治疗策略，它利用小分子劫持细胞内的天然降解途径来诱导蛋白降解。与传统仅阻断组分活性的抑制剂不同，TPD可以直接消除目标蛋白（POIs），为治疗癌症、神经退行性疾病和其他病理提供了有希望的方法。[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]
TPD通过多种机制发挥作用，其中双功能分子是一种有前景的模式。这类分子，如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs），由两个通过连接子连接的配体组成，一个配体与POI结合，另一个配体招募E3泛素连接酶，从而促进POI的多泛素化及随后的蛋白酶体降解。[4]、[5] 同样，自噬结合化合物（ATTECs）被开发出来，可以同时结合自噬相关蛋白LC3和致病蛋白（如突变型亨廷顿蛋白mHTT），利用溶酶体降解途径。[6]
双功能降解剂的一个特征是它们的浓度-响应曲线中的“钩效应”，即在中间浓度下目标蛋白的降解达到最大值，而在更高剂量下降解效果下降。这种现象的发生是因为过高的降解剂浓度会导致目标蛋白或被招募的效应蛋白饱和，形成非生产性的二元复合物，从而阻碍了降解所需的三元复合物的形成。值得注意的是，“钩效应”的强度在不同降解剂系统中有所不同。这些浓度依赖性行为直接影响治疗窗口和给药方案，因此理解这些行为对于开发临床可行的降解剂至关重要。[8]、[9]
最近的研究表明，双功能降解剂的降解行为受二元和三元平衡解离常数的控制，以及它们之间的比率——协同性因子α =。这里，α > 1表示正协同性，使三元复合物稳定；而α < 1表示负协同性，导致三元复合物不稳定。[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17] 此外，三元复合物的解离速率常数也被证明会影响初始降解速率，从而影响降解剂发挥作用所需的时间。[11] 因此，全面表征平衡和动力学参数对于合理设计降解剂及其作用机制至关重要。
虽然二元结合的表征相对简单，但确定三元和的方法在技术上仍然具有挑战性。[13] 一些基于溶液的技术，如时间分辨荧光能量转移（TR-FRET）、荧光极化（FP）和等温滴定量热法（ITC），已被用于测量三元复合物的平衡解离常数。[9]、[10]、[12]、[17] 此外，基于表面的分析方法，包括生物层干涉测量（BLI）和表面等离子体共振（SPR），可以在固定目标蛋白的情况下直接测量动力学速率常数，同时提供平衡常数信息。[10]、[11]、[15]、[17] 然而，由于三元复合物形成的复杂浓度依赖性，以及钩效应的复杂影响，准确表征和仍然具有挑战性。因此，仅仅依赖较高浓度往往会导致次优条件，使得系统识别最佳浓度成为一个核心的方法学难题。
为了解决这一挑战，我们基于易于测量的二元平衡解离常数开发了一个理论和实验框架，以提供三元复合物形成的最佳条件。该框架建立了值与最大三元复合物产率所需最佳浓度之间的直接关联，同时也定义了1:1朗缪尔模型适用于三元相互作用的具体条件。我们的结果确定了准确动力学表征的三个关键要素：实施预孵育协议、策略性地选择固定蛋白组分，以及验证系统是否满足基本的协同性条件。使用Cereblon（CRBN）/ARV-825/BRD4模型系统和斜入射反射率差异（OI-RD）生物传感器进行的实验验证证实了这些理论推导的原则。
部分摘录
双功能降解剂诱导的三元系统中的动力学和平衡参数
图1展示了一个由双功能降解剂（分子B）诱导的三元相互作用系统。该系统包括分子A与B之间的二元相互作用，以及分子B与C之间的二元相互作用。形成二元复合物AB的结合速率常数表示为，其解离速率常数表示为。分子A与B之间的相应平衡解离常数定义为。这些动力学和平衡参数遵循相同的命名规则。
三元复合物形成的平衡分析
我们首先研究了在表面固定组分A的测定配置中，组分B和C的浓度以及协同性因子α如何影响三元复合物的平衡浓度。由于基底上可用的结合位点有限，这种配置导致组分A的有效浓度非常低。
图2(a)显示了通过数值求解得到的[ABC]/[A]t作为[B]t和[C]t的函数
讨论
本研究建立了一个综合的理论和实验框架，用于表征目标蛋白降解系统中的三元复合物动力学。我们的分析表明，可以使用二元解离常数预测最佳的三元复合物形成，而预孵育对于维持可靠的动力学测量所需的恒定复合物浓度至关重要。
在CRBN/ARV-825/BRD4模型系统中的实验验证显示了强烈的正协同性
结论
本研究建立了一个综合的理论和实验框架，用于分析目标蛋白降解中的三元复合物动力学。我们证明，仅通过二元结合参数就可以指导三元复合物形成的优化。通过适当的实验设计，包括使用校准浓度的预形成二元复合物和策略性地固定结合能力较弱的组分，可以确保测量的有效性。
CRediT作者贡献声明
米岚：资源提供。马勇：资源提供。朱向东：软件、资源提供。丁宇：写作——审稿与编辑、资源获取、正式分析、数据管理。夏欢梅：写作——初稿撰写、验证、方法学设计、实验研究、正式分析、数据管理。杨罗：写作——初稿撰写、资源提供、正式分析、数据管理。方若欣：实验研究、正式分析、数据管理。张海娜：数据管理。费一岩：写作——审稿与编辑
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在准备本工作时，作者使用了Deepseek进行语言润色。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。
资金来源
本工作得到了中国国家重点研发计划（2021YFA0805200）、国家自然科学基金（32271510, 82030106, 62175036, 62175034）、中国国家重点研发计划（2021YFF0502900）以及上海光操控超表面重点实验室（23dz2260100）的支持。
