《Carbohydrate Research》：Influence of N- and O-glycosylation on structural properties and biological activity of a C-terminal LL-37 fragment
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糖基化修饰影响LL-37片段金属结合与构象研究，通过固相合成技术制备O-和N-糖基化衍生物，结合荧光光谱和分子动力学模拟分析显示糖基化降低构象柔性并减少金属结合能力，细胞毒性实验证实所有变体在100μM浓度下对正常细胞无毒性。
达莉亚·格日瓦茨（Daria Grzywacz）|弗朗切斯卡·努蒂（Francesca Nutti）|克日什托夫·扎莫伊奇（Krzysztof ?amoj?）|谢尔盖·A·萨姆索诺夫（Sergey A. Samsonov）|马塞利娜·马利诺夫斯卡（Marcelina Malinowska）|马尔戈扎塔·帕杜辛斯卡（Ma?gorzata Paduszyńska）|安娜·玛丽亚·帕皮尼（Anna Maria Papini）|乔安娜·马科夫斯卡（Joanna Makowska）
格但斯克大学化学系，维塔·斯特沃萨街63号，80-308格但斯克，波兰
摘要
糖基化是一种多功能的策略，用于肽的糖工程改造，以调节抗菌肽（AMPs）的结构、物理化学和生物特性。在这项研究中，我们报告了通过固相肽合成方法制备了人类 cathelicidin LL-37 C-末端片段的 O- 和 N- 糖基化类似物（Ac-DFLRNLVPRTES-COOH），其中使用了 Fmoc-Thr(β-D-Glc) 和 Fmoc-Asn(β-D-Glc) 作为糖基化构建块。通过稳态荧光光谱法评估了这些糖肽（N163 和 T168）以及未修饰的参考肽（hCAP）对 Cu2+ 和 Mn2+ 离子的结合亲和力。所有肽都形成了非永久性复合物（Ka = 102 -104 M-1），其中天然的 hCAP 表现出最高的亲和力。分子动力学（MD）模拟显示，糖基化降低了肽的构象灵活性，但并未显著改变其整体形状。观察到偶尔的糖-金属接触，表明碳水化合物参与了金属的配位。使用 MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物）测定法进行的细胞毒性研究表明，所有测试肽都具有生物相容性，对人类成纤维细胞、角质形成细胞和 T 细胞的毒性在 100 μM 以下。我们的结果表明，碳水化合物的结合会微妙地重塑肽-金属离子的相互作用和结构动态。在这项研究中，糖基化主要作为一种翻译后修饰的化学模型，用于探究碳水化合物基团的存在如何影响肽的构象和配位行为，而不是为了增强抗菌功能。
引言
耐药菌株的日益普遍使得寻找新型抗菌剂成为全球性的紧迫任务，这凸显了需要发现细菌尚未产生抗性的新化合物的作用机制。
抗菌肽（AMPs）是很有前景的替代品之一，它们被用作一类新型治疗手段，旨在对抗耐药细菌和真菌。AMPs 是先天免疫系统的一部分，在人类和动物体内作为抵御多种微生物病原体的第一道防线。除了直接的抗菌作用外，AMPs 还能调节免疫反应、伤口愈合和炎症，显示出作为治疗剂和传统抗生素替代品的潜力。目前有许多合成 AMPs 正在临床试验中，用于治疗糖尿病足溃疡或化疗相关感染等疾病。然而，它们的临床应用常常受到代谢稳定性低和在生理条件下被蛋白酶快速降解的限制。因此，人们采用了诸如引入非天然氨基酸或肽模拟物等策略来解决这一问题。
AMPs 与病原体的相互作用方式多种多样，包括破坏膜结构、生成活性氧（ROS）、抑制细胞壁合成、核酸和蛋白质合成或去除必需金属离子。鉴于目前的知识水平，研究人员正在探索各种策略来增强基于肽的化合物的抗菌性能。
其中一种策略是 AMPs 的糖基化（gAMPs），即通过共价方式将碳水化合物基团连接到相应的氨基酸（通常是丝氨酸、苏氨酸或天冬酰胺）的侧链上。糖基化是一种有效的化学方法，可以提高肽的稳定性，增强其对生物环境中蛋白酶和酶的降解抵抗力，从而显著延长肽的体内半衰期。此外，亲水糖残基的引入可以调节肽的亲水性和构象灵活性，减少聚集倾向，并可能拓宽其生物活性范围。gAMPs 为对抗日益严重的抗菌药物耐药性提供了新的工具，在低浓度下对多种病原体有效。
多项研究探讨了糖基化（尤其是 N-连接的糖基化）对肽性质的影响，包括增加刚性、溶解度、聚集倾向、肽二级结构的构象变化以及它们与邻近肽的相互作用。值得注意的是，这种特性使糖肽具有类似伴侣蛋白的特性，并被认为在防止导致淀粉样疾病的纤维形成方面具有保护作用。
另一种改善 AMPs 性质的策略是将它们与生物活性金属离子结合。生物必需的金属离子对抗菌肽的活性具有双重影响：首先，AMPs 可以结合这些离子，从而隔离对微生物生命和毒力至关重要的金属（称为营养免疫机制）；其次，金属离子本身可以通过影响肽的电荷和/或结构来增强其抗菌活性。例如 Zn2+、Cu2+ 和 Fe2+ 等离子可以起到关键作用。将肽与这些离子结合可以通过改变肽的电荷和结构来增强其固有活性，或者剥夺细菌所需的金属，从而抑制其生长。
人类 cathelicidin 抗菌肽（hCAP18）是一种多功能宿主防御蛋白，存在于多种上皮和免疫组织中，通过直接的抗菌活性、免疫细胞趋化作用和调节炎症过程来参与先天免疫反应。经蛋白酶 3 作用后，hCAP18 被切割释放出活性肽 LL-37 [hCAP(134–170)]。LL-37 是一种由 37 个氨基酸组成的两亲性 α-螺旋肽，具有广谱的抗菌、抗真菌、抗病毒和免疫调节作用。
在本研究中，我们研究了 LL-37 的 C-末端 12 个氨基酸片段（Ac-DFLRNLVPRTES-COOH），该片段相比 KR-12、FK-12、FK-16 或 LL-25 等已广泛研究的较短片段来说，研究较少。大多数结构-活性研究集中在 LL-37 的 N-末端和中心片段上，因为这些片段具有强烈的抗菌活性和明确的疏水螺旋结构。然而，C-末端域受到的关注较少。有证据表明，该区域可能锚定膜并中和脂多糖（LPS）的活性。该区域含有带电和极性残基（Asp159、Glu169、Thr168、Ser170），可能作为潜在的配位或修饰位点，使其成为研究化学衍生物的理想模型。
本研究基于先前关于全长 LL-37 及其缩短类似物的基础研究，特别是关于金属离子配位和构象灵活性的研究。早期研究表明，全长肽能与 Cu2+ 和 Zn2+ 离子形成不稳定但可测量的复合物。虽然这些研究强调了特定氨基酸侧链在金属结合中的作用，但当前的工作探讨了糖残基的引入如何影响肽的金属结合性质和结构行为。我们使用光谱技术评估了糖基化 LL-37 片段与选定金属离子（Cu2+ 和 Mn2+）的结合亲和力。选择这些金属离子是因为它们的生物学相关性和互补的配位特性：Cu2+ 常形成相对稳定的复合物（部分受配体场控制），而 Mn2+ 更不稳定，通常优先与氧供体相互作用。此外，还进行了基于分子动力学的严格分析，以评估糖基化对 LL-37 C-末端片段主导构象的影响，并提供其与选定金属离子复合物的原子级模型，以建立该分子系统的结构-功能关系。最后，进行了生物测定，以评估合成糖肽的细胞毒性和抗菌活性。
合成方法
在这项研究中，我们设计并合成了三种源自 LL-37 肽 C-末端片段的肽变体（DFLRNLVPRTES）。所有肽的 N-末端都被乙酰化，并且含有自由的 C-末端羧基。这种修饰策略反映了 hCAP18 中全长 LL-37 序列的天然化学末端：N-末端因蛋白酶处理而被阻断，而 C-末端保持未酰胺化状态。
结论
本研究探讨了特定位点糖基化对 LL-37 C-末端片段结构和金属结合性质的影响。合成了两种糖基化类似物：T168（通过 O-糖基化修饰苏氨酸残基）和 N163（通过 N-糖基化修饰天冬酰胺残基）。研究重点关注了这些修饰对金属结合、构象变化和抗菌活性的影响。
荧光光谱显示，所有肽都表现出较弱的结合亲和力。
糖基化构建块的通用合成方法
所有溶剂和化学试剂均来自商业供应商，无需额外纯化。使用 Bruker Avance III 光谱仪（工作频率分别为 500.13 MHz 和 125.76 MHz）获取了 1H 和 13C 的核磁共振（NMR）光谱。质谱在正离子模式下使用 Bruker Biflex III MALDI-TOF 光谱仪记录。薄层色谱（TLC）在涂有 E. Merck Kieselgel 60 F254 硅胶的铝板上进行。
作者贡献声明
安娜·玛丽亚·帕皮尼（Anna Maria Papini）：撰写、审稿与编辑、监督。乔安娜·马科夫斯卡（Joanna Makowska）：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。马塞利娜·马利诺夫斯卡（Marcelina Malinowska）：方法学、研究。马尔戈扎塔·帕杜辛斯卡（Ma?gorzata Paduszyńska）：方法学、研究。克日什托夫·扎莫伊奇（Krzysztof ?amoj?）：撰写、审稿与编辑、方法学、研究、数据管理。谢尔盖·A·萨姆索诺夫（Sergey A. Samsonov）：方法学、研究、数据分析。达莉亚·格日瓦茨（Daria Grzywacz）：撰写——利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
资助
本研究得到了 UGrant-advanced Nr533-T000-GA-17-24（格但斯克大学）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
