《Current Opinion in Biotechnology》：Advances in multiplex precision genome editing in eukaryotic and prokaryotic systems
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这篇综述聚焦于不依赖DNA双链断裂（DSBs）的多重精确基因组编辑（MGE）前沿技术。它系统梳理了碱基编辑（BE）、先导编辑（PE）及其相关基因组重写平台，并阐述了其在多基因控制、复杂性状工程及安全细胞疗法等领域的应用前景，为生物技术与农业领域的精准基因组操作提供了全面视角。
多重精确基因组编辑的进展
引言
精确操纵基因组信息的能力已经彻底改变了现代生物学，在生物医学研究、生物技术和农业领域实现了重大进展。在过去的十年中，可编程核酸酶，尤其是CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白）系统，将基因组编辑从一项技术要求高、通量低的努力转变为一个通用且广泛可及的平台技术。这个领域的一个核心前沿是多重基因组编辑（MGE），其目标是在单个细胞内同时引入对多个基因组位点的修饰。MGE正成为剖析多基因性状、重建多基因调控网络、设计复杂代谢途径以及生成复杂疾病模型的必要工具。通过协调的遗传扰动，多重编辑方法相较于单一位点方法，能够实现对复杂生物系统更细致、更组合式的调控，并且能更近似地模拟性状和/或生化通路如何被自然发生的基因调控网络所调控。
然而，基于SpCas9的多重编辑广泛应用受到若干内在限制，包括严格的原间隔序列临近基序（PAM）要求、对DNA双链断裂（DSBs）的依赖，以及对通常效率低下或易出错的内源性DNA修复途径的依赖。这些限制对需要高精度、可预测结果或在许多位点进行广泛组合编辑的应用构成了重大挑战。
为了应对这些挑战并扩展MGE的功能范围，超越SpCas9的多样化下一代基因组编辑技术已经出现。这些方法将工程化的可编程靶向核酸酶或切口酶与一系列生化效应器配对，以提高编辑精度，扩大靶向灵活性，并且关键地实现不引入DSB的多重遗传修饰。支持这一发展的主要创新包括碱基编辑（BE）和先导编辑（PE）。同时，整合酶连接系统和基于逆转录转座子的平台可以促进无痕DNA整合、大规模基因组重写和连续的体内多样化。总的来说，这些进展已将MGE从单一位点编辑的直接扩展，转变为一个用于在广泛生物体中精确安装确定基因组编辑的模块化且通用的工具包。
多重碱基编辑
多重碱基编辑（MBE）能够在不诱导DSB的情况下，在多个基因组位点同时引入精确的核苷酸替换，这对于需要可预测编辑结果和减少基因毒性的应用尤其有吸引力。通过共同递送一个碱基编辑器与多个gRNA，MBE已成功应用于多种生物系统。
在哺乳动物系统中，许多治疗开发的高优先级领域，例如工程化同种异体嵌合抗原受体（CAR）-T细胞，得益于MBE提供的高精度和高效率。在微生物和真菌系统中，MBE已成为合成生物学和代谢工程的有效工具。例如，在枯草芽孢杆菌中，对核糖体结合位点的MBE已被用于定量调控整个代谢途径的基因表达，重定向碳通量，并显著提高番茄红素产量而不破坏编码序列。类似地，在丝状真菌中，MBE促进了调控元件的组合扰动，支持系统地激活隐蔽的生物合成基因簇，并加速了天然产物的发现。
额外的多重控制层次已通过使用正交RNA支架和其他适体-蛋白质相互作用模块实现，使得能够同时部署不同的BE活性或将BE与其他基因组扰动模式整合。通过持续整合蛋白质工程、RNA结构设计和基因表达控制，MBE正在稳步扩展跨多种生物系统的精确基因组工程设计空间。
多重先导编辑及相关系统
先导编辑提供了额外的灵活性，以整合碱基编辑不易实现的小的、期望的编辑，使其成为探究特定遗传变异功能的有力工具。最近的工作表明，稳定表达PE机制并结合大型先导编辑引导RNA（pegRNA）库的工程细胞，可用于高通量筛选变异效应。这些筛查策略扩展到更多基因和功能表征不良的基因组区域，预计将产生关于基因调控和疾病分子机制的新见解。
除了筛查应用，多重先导编辑（MPE）在作物精确基因组工程中的应用日益增加。在水稻中，模块化pegRNA组装策略使得能够同时先导编辑多个农艺重要性基因，而替代性PE系统简化了pegRNA设计并提高了多个位点的编辑效率。同样，在六倍体小麦中也展示了高效的MPE，突显了即使是在高度复杂的多倍体基因组中进行不依赖DSB的多重精确编辑的可行性。
与MBE类似，MPE的许多实际和治疗应用需要经过编辑的细胞在一次扰动中获得均匀的编辑组合，而不是通过随机递送来自混合库的单个gRNA。为此，最近的研究使用大容量递送系统，例如杆状病毒衍生载体，将PE机制与多个pegRNA一起包装在确定的启动子下，在人类细胞系中实现高效的MPE。展望未来，进一步扩展MPE系统，包括使用更长的gRNA阵列或额外的辅助基因组扰动效应器，将需要对PE蛋白和pegRNA结构进行协同工程化，以确保在多种细胞环境中具有鲁棒的性能。
在机制上与PE不同但概念相关的逆转录转座子介导的MGE，为不依赖DSB的精确编辑提供了另一种途径。通过将逆转录转座子介导的单链DNA供体整合与基于CRISPR的靶向相结合，这种方法能够同时引入多种编辑，包括替换、插入和缺失，并支持连续的体内多样化。因此，基于逆转录转座子的系统为细菌系统中的快速进化工程提供了一个有前景的平台。尽管目前的实现主要在细菌系统中，基于逆转录转座子的平台突显了超越经典Cas9基PE方法的多重精确编辑的扩展设计空间。
超越CRISPR系统的多重基因组重写
除了由碱基编辑器和先导编辑器实现的核苷酸级精确编辑外，一类不断扩展的基因组工程技术通过可编程DNA重组和整合，在不依赖CRISPR系统的情况下实现多重“基因组重写”。这些酶系统通过在更高层次的基因组组织上运作，催化大规模的靶向插入、缺失、倒位或盒式交换。重要的是，它们的正交性和模块化使这些系统特别适合于跨不同生物体的可扩展多重基因组操作。
位点特异性重组酶，如Cre、Flp和φC31，长期以来一直被用作条件性基因组操作的工具。然而，早期应用受到正交靶点缺乏和重组事件间交叉反应性的限制。定向进化和理性蛋白质工程学的进展已大大扩展了这个工具包。重组酶系统也被用于可编程控制基因组结构而非静态序列修饰。最近开发的真核多重位点特异性倒位系统能够同时且可逆地倒位多个基因组片段，为重新连接调控和代谢网络提供了一种动态手段。应用于代谢工程，这种方法允许通过切换基因方向和调控背景来组合探索通路配置，而无需引入永久性DNA损伤。
连接CRISPR介导的靶向与重组酶化学，RNA引导的整合酶代表了另一类能够进行多重基因组重写的酶。CRISPR相关转座酶和整合酶系统将RNA引导的DNA识别与大片段DNA的位点特异性整合相结合，从而实现高效MGE而无需形成DSB。这些系统在细菌中的演示显示，能够在确定的基因组位置同时高效插入多个遗传元件，建立了一条可编程的、大规模基因组重写的途径，该途径与CRISPR-Cas9介导的编辑正交。虽然这些系统目前在原核背景下特征描述最为清楚，但RNA引导的整合酶为未来的真核基因组工程平台提供了一个引人注目的蓝图。与BE或PE相比，这些系统不太适合细微的序列改变，但在可预测、正交且可扩展地操纵大片段基因组元件方面表现出色。随着工程策略继续提高这些效应器的特异性、正交性和诱导性，基因组重写技术可能在合成染色体设计、代谢通路优化和长期细胞记忆编码等应用中发挥越来越核心的作用。
结论、挑战与未来展望
得益于过去十年中的重要发展，精确MGE技术现已确立为跨多样生物系统进行协调多基因修饰的可靠且灵活的方法。在哺乳动物、植物、真菌和细菌中的概念验证研究共同证明，MGE能够实现可预测的编辑结果，同时克服与传统CRISPR策略相关的许多局限。尽管取得了这些进展，但重大挑战仍然限制了其在生物体、组织和应用领域的更广泛采用。即使MGE机制在已充分表征的位点上表现高效，扩展到新的基因组位点也需要从大的组合设计空间中进行系统性设计和优化的gRNA的经验性评估。继续开发高通量引导RNA优化方法，以及改进计算工具以最小化引导干扰和竞争，对于促进MGE在治疗和农业背景下的更广泛应用至关重要。
与此同时，将MGE机制高效递送到目标细胞和组织仍然是广泛采用的主要障碍，特别是在具有复杂多倍体基因组以及妨碍遗传转化的细胞结构的植物系统中。MGE可用于扰动的细胞行为的概念范围也正在发生显著变化。早期的努力主要集中在组合基因敲除或致病性变异纠正，而碱基编辑和先导编辑的最新进展突显了MGE在实现多重和定量基因表达调控方面的潜力。靶向调控元件、非翻译区、表观遗传调控因子和翻译控制序列，能够对基因表达、代谢通量和调控网络行为进行分级和可预测的微调。这种策略对于代谢工程、天然产物发现和作物改良特别有效，在这些领域，跨多个位点的细微且协调的扰动通常优于依赖简单激活或失活的二元遗传干预。
最后，MGE现在涵盖了不断扩展且日益多样化的可编程基因组效应器库。虽然经过广泛工程化的平台如Cas9继续为基因组操作提供基础，但较新的效应器和非CRISPR系统，特别是基于重组酶和整合酶的技术，正通过提高正交性、减少PAM要求以及支持更大或更复杂的基因组修饰来拓宽多重编辑的范围。这些效应器的持续多样化和优化将提供更大的灵活性，包括引入编辑的规模和内容，以及它们对基因调控的影响，从而实现更精确的基因组工程策略并产生更复杂的遗传功能模型。
总之，这些汇聚的进展将MGE定位为探究和操纵生物复杂性的核心技术。蛋白质工程、基因组生物学、递送科学和计算生物设计领域的持续进展正在迅速扩展精确MGE的能力。随着这些领域的日益交叉，预计MGE将在未来几年推动生物医学研究、农业和生物技术的重大创新。
