对Tetrastigma hemsleyanum叶片的评估：通过体外消化-Caco-2-HT-29模型研究其消化、吸收及抗炎作用

《Food Bioscience》：An Evaluation of Tetrastigma hemsleyanum Leaves: Digestion, Absorption and Anti-inflammatory Effects via an In Vitro Digestion-Caco-2-HT-29 Model

研究采用体外模拟消化结合Caco-2细胞模型，系统探讨Tetrastigma hemsleyanum叶（THL）的消化吸收特性及其抗炎机制。结果表明THL经消化后释放的6种可吸收成分通过Caco-2细胞模型验证其肠道转运能力，并显著抑制TNF-α诱导的HT-29细胞炎症反应，其机制涉及Keap1/Nrf2通路激活及HO-1表达上调，为建立“消化-吸收-活性”研究范式提供新证据。

　　

肖丽华|毕欣|薛艳华|潘峰|张华|蒋莉|孙勇

中国江西省南昌市南昌大学食品科学与资源国家重点实验室，邮编330047

摘要

Tetrastigma hemsleyanum的叶子（THL）是一种传统的可食用和药用多年生植物，以其多样的生理活性而闻名，包括在体内对溃疡性结肠炎的有效性。本研究采用了一种结合模拟消化模型和Caco-2细胞单层模型的综合体外方法，探讨了THL中生物活性成分的消化和吸收过程。此外，我们还在人类结直肠腺癌细胞系（HT-29细胞）炎症模型中评估了THL体外消化成分的抗炎特性和机制。研究发现，THL中的六种成分可以被Caco-2细胞吸收和转运。尽管在消化过程中抗氧化能力有所下降（主要是由于酚类和黄酮类化合物的丢失），但消化后的THL仍具有显著的抗炎活性。消化后的THL通过Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核因子红系2相关因子2（Nrf2）通路（可能通过血红素加氧酶-1（HO-1）介导）减轻了HT-29细胞中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的炎症。通过整合体外消化、吸收和抗炎模型，本研究建立了一个“消化-吸收-生物活性”的研究范式，为THL在胃肠道中的命运和生物活性提供了基础性的见解。

引言

Tetrastigma hemsleyanum是传统医学和饮食实践中使用多年的多年生植物。Tetrastigma hemsleyanum的叶子（THL）富含多酚类化合物，尤其是槲皮素和山柰酚等黄酮类物质、绿原酸和咖啡酸等酚酸以及白藜芦醇衍生物。这些生物活性成分显著增强了其抗氧化和抗炎特性，从而在清热、解毒、保护肝脏和管理炎症性疾病方面具有民间应用价值。³尽管THL具有明确的药用价值，并被广泛用于功能性食品（如茶、口服液和含片）中，且其栽培技术也得到了成功推广，但由于缺乏坚实的理论基础，其产品开发仍然受到限制。因此，系统地阐明其药理活性物质和机制是推动可持续工业发展的关键科学前提。目前，关于THL的研究主要集中在其地下部分的多糖上，探讨了它们的免疫调节、降糖和抗菌作用。⁴⁵⁶最近，我们的团队将研究重点转向了其地上部分。我们进行了全面的化学分析、体内代谢研究以及体外和体内的抗肿瘤活性评估，并研究了其修复大鼠氧化损伤的潜力。¹²⁷此外，我们还证明了THL酒精提取物可以缓解硫酸葡聚糖钠（DSS）在小鼠模型中引发的溃疡性结肠炎。机制研究表明，Keap1/Nrf2信号通路是关键调节因子，可能通过与多酚类成分的相互作用来调节氧化应激和炎症通路。⁸尽管取得了这些进展，但其体外的抗炎机制和关键生物活性成分仍不完全清楚。因此，进一步研究其地上部分的生物活性物质和分子机制至关重要。

本研究利用两种互补的体外细胞模型来研究THL的转运特性和抗炎潜力。Caco-2细胞系是一种成熟的吸收性肠上皮细胞模型，在形态和功能上与人体肠道上皮高度相似。⁹当细胞达到汇合状态时，它们会分化并极化，形成具有紧密连接的单层结构，从而可以研究与口服吸收相关的被动扩散、主动转运和代谢过程。体外Caco-2单层通透性与体内吸收数据之间的高相关性（r² = 0.92）验证了该模型的预测价值。¹⁰该模型已成功用于研究多种天然产物的吸收。¹¹它非常适合评估THL生物活性成分的跨膜吸收潜力——这是研究其系统或局部生物活性的关键第一步。为了模拟结肠炎症环境，我们使用了HT-29细胞系，这是一种可以分化为杯状细胞的结直肠腺癌细胞系。与吸收性Caco-2模型不同，HT-29细胞具有分泌功能，能够模拟结肠黏液屏障。¹²¹³更重要的是，HT-29细胞对炎症刺激表现出更高的敏感性，这归因于它们表面高表达的TLR4等受体¹⁴以及对IFN-γ等细胞因子的强烈反应¹⁵。这使得它们成为评估消化后THL成分抗炎活性的合适且敏感的系统。通过整合这两种模型，我们建立了Caco-2单层模型来研究THL成分的吸收和转运，并使用细胞因子刺激的HT-29细胞来评估其抗炎效果。这种结合体外的方法可以精确控制实验条件，并为未来的体内研究提供基础性的机制数据。

氧化应激源于活性氧（ROS）与机体中和能力之间的不平衡，导致细胞损伤。¹⁶它与炎症密切相关，共同形成了一个自我持续的循环，引发并加剧了多种疾病。¹⁷Keap1/Nrf2通路是细胞防御的关键调节因子，能够对抗氧化应激和炎症。其激活可以抑制促炎性的NF-κB通路。¹⁸一个关键机制涉及Nrf2诱导的HO-1，它通过阻止NF-κB抑制因子IκB的降解来抑制NF-κB信号通路，从而减少炎症基因的表达。¹⁹THL的抗炎效果可能通过Nrf2激活与NF-κB抑制之间的相互作用来介导；然而，具体机制尚未完全阐明。

因此，本研究主要关注Tetrastigma hemsleyanum的地上部分，旨在通过体外模拟消化模型和Caco-2细胞吸收模型来评估其消化和吸收过程。此外，还探讨了THL在体外消化后对结肠细胞的潜在抗炎作用及其相关机制。我们首次通过整合体外消化/吸收/抗炎评估，建立了THL的“消化-吸收-生物活性”研究范式。这种方法为阐明草药提取物的胃肠道命运和后续生物活性提供了全面的框架，为未来研究传统上因健康益处而被消费的植物的功能特性提供了坚实的方法论基础。

材料与试剂

Tetrastigma hemsleyanum叶子购自中国上饶红太阳农业发展有限公司。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）购自北京Solarbio科技有限公司。胎牛血清购自Biological Industries Technology有限公司。抗Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC、Claudin-1、Occludin、Lamin B、GAPDH抗体购自美国马萨诸塞州丹弗斯的Cell Signaling Technology公司。

体外消化后总酚类、总黄酮类含量和抗氧化能力的改变

我们采用体外消化模型模拟THL提取物在口腔、胃和肠道阶段的传递过程，同时监测总酚类（TP）含量、总黄酮类（TF）含量和抗氧化能力的变化。如图1A-B所示，经过口腔、胃和肠道消化后，TP和TF含量均逐渐下降。口腔消化后，TP从406.68 ± 2.86 mg GAE/g DW下降到364.51 ± 2.00 mg GAE/g DW，TF从216.84

讨论

细胞炎症和氧化应激密切相关，两者以双向方式相互影响。具有抗氧化特性的天然产物在调节炎症过程方面显示出巨大潜力。Tetrastigma hemsleyanum是一种传统的药用植物，其地上部分最近在现代食品和健康补充剂行业中受到了关注。先前的研究已经证明了THL的抗氧化和抗炎活性，

结论与局限性

本研究系统地研究了THL在胃肠道中的稳定性、其消化成分的肠道转运及其随后的抗炎活性。初步确定六种生物活性成分可以通过Caco-2单层进行转运。值得注意的是，尽管在消化过程中整体抗氧化能力有所下降，但这些转运成分在TNF-α诱导的HT-29细胞中仍表现出显著的抗炎效果。

CRediT作者贡献声明

毕欣：撰写——审稿与编辑、研究。肖丽华：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、软件使用、项目管理、方法学、研究、数据分析、数据整理。孙勇：验证、监督。潘峰：概念构思。薛艳华：方法学。张华：验证、方法学。蒋莉：研究

未引用参考文献

33.; 34.; 35.; 40.; 41.; 42.; 45.; 46.; 48.; 49.

利益冲突

本文作者不存在任何可能影响本研究工作的利益冲突。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了江西省营养与健康管理培养项目（项目编号2023-YBPY-02）和九江细胞治疗重点实验室开放基金（项目编号JYKF2024005）的资助。