《Food Bioscience》：Systematic engineering of
Bacillus amyloliquefaciens for efficient bovine lactoferrin production
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利用毕赤酵母分泌表达系统通过优化核糖体结合位点、设计新型信号肽及共表达分子伴侣实现牛乳铁蛋白高效生产，5升生物反应器中最终产量达110 mg/L，为功能性蛋白发酵提供新策略。
李颖|李珍|毛素阳|杜珊珊|李莎|徐虹|雷鹏|邱一斌
南京工业大学食品科学与轻工学院，中国南京211816
摘要
牛乳铁蛋白（BLF）是一种高价值的多功能蛋白质，以其铁结合能力和广谱抗菌特性而闻名。尽管它作为一种功能性食品成分具有潜力，但由于天然来源中含量低且提取成本高，其工业应用受到限制。为了解决这一瓶颈，本研究首次成功地在公认安全（GRAS）宿主Bacillus amyloliquefaciens中实现了重组BLF的分泌表达。最初，工程菌株的产量为18.0 ± 0.3 mg/L。为了提高分泌效率，采用了系统工程优化策略，包括优化核糖体结合位点（RBS）并融合一种新的植酸酶衍生信号肽（SPphy）以促进转运。关键的是，还共表达了分子伴侣PrsA以减轻折叠压力。这些改进最终使产量提高了6.1倍，在5升生物反应器中达到了110.0 ± 0.8 mg/L的最终产量。这项研究不仅证明了B. amyloliquefaciens作为BLF生产平台的可行性，还为其他复杂营养蛋白的异源生物制造提供了战略框架。
引言
牛乳铁蛋白（BLF）是一种非血红素铁结合蛋白，属于转铁蛋白家族（Cui等人，2022；González-Chávez等人，2009）。结构上，BLF由两个同源的叶状结构（N-叶和C-叶）通过一个灵活的α-螺旋连接而成，每个叶状结构都能可逆地结合Fe3+并协同作用（Baker & Baker，2009；Moore等人，1997）。这种独特的铁螯合能力不仅提高了铁的生物利用度，还通过稳定游离铁来减轻胃肠道刺激（Berlov等人，2007）。除了铁稳态外，BLF还具有广泛的生理活性，包括抗氧化、抗菌、免疫调节和益生元作用（Actor等人，2009；Dyrda-Terniuk & Pomastowski，2023；Wallace，2016）。因此，BLF已成为功能性食品、婴儿配方奶粉和临床营养中的高价值成分。随着健康意识的提高，预计到2032年全球BLF市场将达到9.699亿美元（Ostrowska等人，2025）。然而，目前的工业供应主要依赖于从牛奶或乳清中提取。这种方法受到天然含量低、纯化成本高和显著环境足迹的阻碍（Hu等人，2024）。这些供应方面的瓶颈需要开发可持续、可扩展的生物技术替代方案。
合成生物学为BLF的精准发酵提供了有前景的途径，可以实现可控、高效且环境可持续的制造过程。然而，确定最佳表达宿主仍然是一个挑战。大肠杆菌作为重组蛋白合成的主要宿主之一，由于其复杂的遗传工具箱、易于培养的协议以及在大规模发酵过程中的经济可行性，一直是最早研究BLF表达的平台之一。例如，Montoya等人将硫氧还蛋白（Trx）与全长牛乳铁蛋白融合并在E. coli中表达，获得了15.3 mg/L的重组BLF产量，纯度为90.3%（García-Montoya等人，2013）。重组E. coli经常产生不溶性的包涵体，因此需要复杂的重折叠程序。此外，革兰氏阴性细菌中的内毒素存在对食品级应用的安全性构成威胁。因此，已经使用了其他细菌表达系统，如Rhodococcus erythropolis，用于BLF C-叶片段的异源表达，并通过逐步透析方法成功获得了生物活性C-叶（W. S. Kim等人，2006）。此外，Komagataella phaffii菌株GS115（以前称为Pichia pastoris）是最广泛使用的真核表达宿主之一，用于BLF生产。利用pPIC9K载体并实施密码子优化和基因剂量调整等策略，该系统实现了高达824.93 mg/L的最终BLF产量（Zhang等人，2025）。然而，这一过程通常需要7-9天，且相对复杂，同时目标蛋白的细胞内积累往往限制了产量并增加了纯化的难度。因此，迫切需要一种具有公认安全（GRAS）状态的微生物平台，能够高效分泌生物活性BLF并缩短发酵时间。Bacillus amyloliquefaciens是一种GRAS状态的革兰氏阳性细菌，由于其快速生长、食品安全性和强大的分泌能力，成为功能性蛋白的理想候选者（Luo等人，2023）。目前，源自B. amyloliquefaciens的新型表达细胞工厂已成功应用于多种酶的生物合成，包括α-淀粉酶（Li等人，2025）、蛋白酶（Jiang等人，2022）和纤维素酶（Bhatt等人，2024）。通过机器学习模型预测和设计新的信号肽显著提高了该细胞工厂中重组蛋白的分泌效率（Li等人，2025）。为了评估这种新型B. amyloliquefaciens宿主菌株合成BLF的潜力，我们实施了一系列系统优化策略，包括筛选最佳分泌表达宿主、设计重组表达元件以及优化BLF的翻译、分泌和折叠过程。这种方法旨在解决重组BLF在微生物表达宿主中面临的关键问题，如溶解度差、分泌效率低和产量不足。最终，我们建立了一种高效的生物技术合成途径，适用于从食品级原料直接生产BLF。这种方法为当前的动物基供应链提供了可行的替代方案，并为BLF的发酵生产提供了实用的解决方案。
部分内容摘录
细菌菌株、质粒和化学品
大肠杆菌 DH5α（Invitrogen，上海，中国）用于基因克隆和质粒构建，而E. coli GM2163用于质粒去甲基化。B. subtilis 168和B. amyloliquefaciens SE被用作表达宿主。编码牛乳铁蛋白（BLF；NCBI编号JX294418.1）的基因经过密码子优化，并由General Biosystems（中国滁州）化学合成。3-植酸酶基因（phy）从B. amyloliquefaciens SE的基因组DNA中扩增
重组BLF表达宿主的筛选和评估
Bacillus属细菌具有强大的天然分泌机制，包括专门的信号肽和伴侣蛋白，有助于蛋白质直接转移到细胞外环境中。这种分泌能力简化了下游纯化过程，并通常促进蛋白质的正确折叠（Yang等人，2021）。为了选择最佳宿主，使用含有AmyE的IPTG诱导pHT43载体评估了两种食品级菌株B. subtilis 168和B. amyloliquefaciens SE
结论
目前BLF的微生物合成面临诸多挑战，包括产量低、生产成本高和生物活性不稳定。因此，开发最佳表达宿主是BLF生物技术研究的关键焦点。为了解决这些问题，采用了系统工程方法，将B. amyloliquefaciens确立为BLF生产的宿主平台。该策略包括筛选功能性
CRediT作者贡献声明
杜珊珊：撰写 – 审稿与编辑，项目管理。李莎：监督，资金获取，概念构思。毛素阳：方法学，研究，数据管理。邱一斌：监督，资金获取，概念构思。徐虹：撰写 – 审稿与编辑，项目管理。雷鹏：监督，资金获取，概念构思。李颖：撰写 – 初稿，软件开发，方法学，研究，数据管理，概念构思。李珍：软件开发
未引用的参考文献
Genoud等人，1999；Masson和Heremans，1971；Montreuil等人，1960；Wang等人，2025；Zhang等人，2025。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFF1103400）和江苏合成生物学基础研究中心（编号BK20233003）的支持。
