《Food Bioscience》：Balancing Dual-Enzyme Expression and Synergistically Engineering of 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase for Efficient 3-Hydroxy-3-Methylbutyrate Biosynthesis by Whole-cell catalysis
编辑推荐：
通过分子对接筛选高效4-羟基苯丙酮酸二氧合酶（AaHPPD），结合Proteus vulgaris来源的L-氨基酸脱氨酶（PvLAAD），构建原核生物整细胞催化系统。优化表达元件（RBS组合）使摩尔转化率提升至56.5%，再通过复合突变（Q65L/E99D/L260I/V306I）增强AaHPPD热稳定性，最终实现73.73%的摩尔转化率。研究建立高效HMB生物合成体系，并系统揭示酶工程与代谢调控协同优化机制。
王梦瑞|吴耀康|吕学勤|李江华|刘龙|杜国成|陈健|刘彦峰
教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，江南大学生物技术学院，中国无锡214122
摘要
3-羟基-3-甲基丁酸（HMB）是L-亮氨酸的关键代谢物，在新肌肉组织生长过程中能够改变蛋白质代谢平衡，并表现出抗分解代谢作用，因此作为治疗肌少症和运动训练的膳食补充剂受到了广泛关注。本研究通过分子对接和全细胞反应验证，从Allokutzneria albata（AaHPPD）中鉴定出一种高效的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶。通过将这种酶与来自Proteus vulgaris（PvLAAD）的L-氨基酸脱氨酶结合进行全细胞生物催化，利用25 mM的L-亮氨酸成功生产出了8.66 mM的HMB，摩尔转化率为34.6%。为了协调途径中酶的表达，优化了核糖体结合位点的组合，使摩尔转化率进一步提高到56.5%。此外，利用Protein Repair One Stop Shop服务器和Disulfide by Design 2技术，发现了增强AaHPPD热稳定性的远端突变。双突变体AaHPPDQ65L/E99D和PvLAAD的共同表达使转化率达到61.24%。为了进一步提高催化活性，基于空间位置对通过丙氨酸扫描鉴定出的四个位点进行了分组饱和突变。最终菌株AaHPPDQ65L/E99D/L260I/V306I和PvLAAD在最佳全细胞条件下使用25 mM的L-亮氨酸作为底物，10小时内实现了73.73%的摩尔转化率。本研究建立了一种高效的全细胞催化生产HMB的方法，并为增强限速酶的热稳定性和活性以及协同优化级联酶的表达水平提供了可行的策略。
引言
3-羟基-3-甲基丁酸（HMB）是一种源自必需氨基酸L-亮氨酸的关键内源性代谢物，由于其强大的蛋白质代谢调节作用，在食品和健康产业中成为了一种关键的生物活性化合物（Gepner等人，2019年；Rowlands和Thomson，2009年；Wilson等人，2008年）。HMB具有通过mTORC1途径刺激肌肉蛋白合成（Wilkinson等人，2013年）和通过泛素-蛋白酶体系统抑制蛋白水解（Nissen等人，1996年；Smith等人，2005年）的双重功能，是管理肌少症和提升运动表现的重要营养干预措施（Robinson等人，2014年）。HMB的安全性和有效性已得到广泛验证，美国将其列为“公认安全”（GRAS）食品，中国卫生部也在2011年批准其作为新型资源食品（Zhou等人，2025年）。随着其应用范围从医疗营养扩展到畜牧业（Wan等人，2016年；Zabek等人，2016年），全球对HMB的需求正在激增。这种快速的市场扩张凸显了开发高效、高产生物合成策略的紧迫性，以确保可持续和具有成本效益的供应。
目前，HMB的工业生产主要依赖于化学合成方法，通常使用次卤酸盐（如NaOCl或NaOBr）通过卤仿反应氧化二丙酮醇（DAA）（Lawrence W. McCoy等人，2002年）。尽管这种方法已经成熟，但它存在显著缺点，包括难以控制放热反应、产生有毒的卤代副产物以及严重的环境污染，需要复杂的下游纯化过程。为了解决这些可持续性问题，微生物生物合成成为了一个有前景的替代方案。一种微生物发酵策略利用Galactomyces reessii的内源途径将β-甲基丁酸（MBA）转化为HMB，在136小时的发酵后可获得38 g/L的产量，摩尔转化率为50%，生产率为0.28 g/(L·h)（Hasegawa等人，1981年；Lee等人，1997年）。然而，这种方法面临底物异味、操作复杂性和竞争性代谢途径等问题。另一种微生物平台是在E. coli中通过甲羟戊酸途径使用葡萄糖作为碳源进行转化的。在1-L生物反应器中，128小时的培养产生了17.7 g/L的HMB，葡萄糖转化效率为0.16 g/g，生产率为0.14 g/(L·h)（Huang等人，2024年），但由于脱羧酶的杂项活性导致副产物积累，使得下游处理变得复杂。
通过L-氨基酸脱氨酶（L-AAD）和4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-HPPD）的协同作用，建立了一个酶级联平台。L-AAD首先将L-亮氨酸转化为亚胺中间体，该中间体自发水解为α-酮异己酸（α-KIC），随后4-HPPD催化氧化脱羧生成HMB。通过对Rattus norvegicus中的RnHPPD进行Q341A突变，减少了底物通道的空间阻碍，使酶活性比野生型提高了20%。在表达RnHPPDQ341A（OD600 = 45）的E. coli Rosetta（DE3）菌株和Proteus vulgaris L-AAD（OD600 = 35）进行10小时的共培养后，产生了1.4 g/L的HMB，生产率为0.14 g/(L·h)（Gao & Li，2021年）。最近，从Bacteroides barnesiae（BbHPPD）中鉴定出一种高效的4-HPPD，并将其与Proteus mirabilis L-AAD结合在E. coli BL21(DE3)中。通过迭代饱和突变得到的工程变体BbHPPDM4，相对于野生型，α-KIC的产量提高了254%。使用20 g/L的L-亮氨酸作为底物，该系统在18小时内产生了11.6 g/L的HMB，摩尔转化率为65%，生产率为0.64 g/(L·h)（Chen等人，2025年）。然而，这些研究主要集中在分子层面的酶挖掘和工程上，较少关注多酶级联反应中表达元件的系统调控。此外，对于工业生物催化而言，热稳定性直接关系到生物催化剂的寿命和稳定性；因此，全细胞催化过程中酶失活和不稳定性的问题值得高度重视。最近的酶工程方法进展改变了传统方法，使得能够设计出具有更高特异性、稳定性和催化效率的酶（Qu等人，2025年）。因此，通过这些先进策略对目标酶进行工程改造，为同时提高催化效率和热稳定性提供了战略机会。
在本研究中，系统整合了途径工程和酶工程以实现高效的HMB生物合成。我们证明了优化表达盒内的基因顺序和RBS序列可以将转化率提高两倍以上。此外，针对远端和近端位点的组合突变策略同时提高了限速酶的热稳定性和酶活性。我们的研究为协调优化生物催化级联中的各个酶以及提高限速酶的催化活性和热稳定性提供了有价值的策略。
与以往的研究相比，本研究整合了系统途径工程和双重属性酶工程。我们证明了优化基因顺序和组合RBS调节可以将摩尔转化率提高两倍以上。具体而言，这种协同表达是主要驱动力，使转化率相对提高了63.29%（从最初的34.6%提高到56.5%）。此外，组合突变策略同时提高了限速酶AaHPPD的热稳定性和催化活性，进一步提高了14.91%。本研究不仅在10小时内实现了73.73%的高摩尔转化率，还为复杂生物催化级联中平衡酶表达和稳定性提供了系统性的路线图。
化学物质和试剂
抗生素和质粒提取试剂盒购自Sangon Biotech（中国上海）。PrimeSTAR Max DNA聚合酶和Rapid Taq Master Mix分别购自Takara Biomedical Technology（中国北京）和Vazyme Biotech（中国南京）。标准α-KIC和HMB购自Macklin（中国上海）。2,4-二硝基苯肼（DNPH）粉末购自Aladdin（中国上海）。
质粒、菌株、培养条件、重组蛋白表达和纯化
使用E. coli BL21(DE3)来合成HMB。质粒组装
在E. coli中构建双酶级联途径用于HMB合成并优化表达系统
在我们的重组E. coli全细胞催化系统（WCCS）中，L-亮氨酸通过L-氨基酸脱氨酶（L-AAD）转化为亚胺中间体，该中间体自发水解形成4-甲基-2-氧戊酸（α-KIC）。随后，α-KIC在4-羟基苯丙酮酸双加氧酶（4-HPPD）的催化下发生氧化脱羧，最终生成HMB（图1A）（Gao & Li，2021）。
来自Proteus vulgaris（PvLAAD）的L-AAD催化氧化脱氨基
结论
通过系统工程，成功构建了一种高效的E. coli菌株用于HMB生物合成。修改策略包括：（1）表达宿主、载体和4-HPPD来源的组合筛选；（2）表达盒中基因位置的比较分析以及RBS序列的组合优化；（3）筛选增强AaHPPD热稳定性的远端突变位点；（4>位点的饱和突变
CRediT作者贡献声明
刘彦峰：撰写——审稿与编辑，验证，监督。吴耀康：撰写——审稿与编辑。王梦瑞：撰写——初稿，方法学，研究，数据分析。吕学勤：数据管理。刘龙：监督。李江华：监督。陈健：项目管理。杜国成：监督
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：鉴于陈健担任主编的职位，他未参与本手稿的同行评审，也未获取任何相关评审信息。本手稿的编辑过程完全由其他编辑处理。鉴于吴耀康担任副主编的职位，他未参与本手稿的同行评审
