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微纳米塑料（PET/PLA）在体外肠道模型中的毒性评估显示，无论是否经历环境降解，均未显著影响细胞毒性、遗传毒性或氧化应激，但在遗传易感模型中观察到部分屏障功能变化。
作者名单：Verane Bard | Margaux Papin | Maeva Boulée | Marion Berenguer | Aliro Villacorta | Daphna Fenel | Emma Dusacq | Ricard Marcos | Alba Hernández | Jacques-Aurélien Sergent | Thierry Douki | Marie Carrière
研究机构：格勒诺布尔阿尔卑斯大学（Université Grenoble Alpes）、法国原子能委员会（CEA）、法国国家科学研究中心（CNRS）、格勒诺布尔高等理工学院（Grenoble-INP）、IRIG、SyMMES-CIBEST，法国格勒诺布尔，邮编38000
摘要
微塑料和纳米塑料（MNPs）对环境的污染引发了人们对它们对人体毒性的担忧，尤其是通过摄入途径。虽然关于原始微塑料的影响已有大量研究记录，但环境降解后的微塑料却仍缺乏足够研究。我们评估了可生物降解和不可生物降解的纳米塑料（NPLs），即聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚乳酸（PLA），在原始状态以及经过环境条件作用后的影响。我们使用HT29-MTX细胞与表达野生型或突变型核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）的Caco-2细胞共培养，构建了一个代表健康人群的体外肠道模型，并将其与易患炎症性肠病（IBD）的遗传易感模型进行了比较。未分化和已分化的细胞分别暴露于这些NPLs 24小时后，对其细胞摄取、细胞毒性、基因毒性、氧化应激、炎症反应以及上皮屏障完整性进行了检测。尽管PET和PLA在细胞内积累，但并未表现出显著的毒性。因此，与聚苯乙烯NPLs的研究结果一致，PLA和PET颗粒在体外急性暴露下不会对肠道细胞造成重大毒性影响，而且在这种暴露条件下，环境降解并不会增加它们的毒性。
引言
日常生活中一次性塑料制品的大量使用，加上不良的废物管理，导致塑料垃圾在自然环境中（如土壤、河流、海洋）积聚，进而使生活在这些生态系统中的动物受到污染，而这些动物又可能进入人类食物链。一旦进入环境，塑料会在阳光、微生物以及机械和热应力的作用下分解成更小的颗粒——即微塑料和纳米塑料（MNPs），从而改变其物理化学性质[1]。人类通过饮用储存在塑料瓶中的饮料或食用包装在塑料容器中的食物而暴露于这些颗粒。据估计，每年通过饮用受污染的自来水，人类会摄入458,000个MNPs；而饮用瓶装水则会摄入超过300万个MNPs，其中大部分为聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）[2]。将沸水倒入塑料杯或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）涂层纸杯中，或者将水倒在聚乳酸（PLA）制成的茶包上，也会释放出一些MNPs并被人体摄入[3]。此外，人类呼吸的空气中也含有来自含有聚合物材料的磨损产生的塑料颗粒，例如汽车轮胎或合成纺织品，这些材料同样会受到环境因素的进一步降解。总体而言，人类可通过皮肤接触、吸入受污染的空气、饮用受污染的水或食用受污染的食物（如生活在受污染环境中的鱼类或无脊椎动物）而暴露于MNPs[4]。已在人体组织中检测到MNPs[5]，这证明了它们能够穿越生物屏障并到达远端器官。MNPs最终通过粪便排出体外，其平均浓度估计在每克湿重2个到28个颗粒之间，其中主要是PET颗粒[6, 7]。研究表明，炎症性肠病（IBD）患者的粪便中MNPs浓度显著高于健康个体[7]，这引发了人们对MNPs对健康人群（尤其是IBD患者）影响的担忧。
关于聚苯乙烯（PS）的大量研究揭示了MNPs在消化道中的行为。当小鼠口服PS MNPs（直径20至5000纳米）时，这些颗粒会在肠道内积聚，引发炎症并破坏肠道屏障功能[8, 9]，并穿过肠道上皮进入血液。体外实验中，在代表健康人群的细胞模型中，观察到一些细胞毒性、自噬诱导、DNA损伤和炎症现象，尤其是在暴露于胺功能化PS的细胞中[10, 11]，重复暴露时这种效应更为明显[12, 13]。尽管部分研究未发现显著影响，但大多数研究仍指出MNPs会在细胞内积累。关于PLA和PET颗粒的毒性，目前了解甚少。体内实验表明，PLA MNPs会释放寡聚物，导致小鼠肠道损伤和急性炎症[14]。PET MNPs会增加海洋轮虫Brachionus koreanus中的活性氧水平和谷胱甘肽S-转移酶活性[15]。体外实验中，从茶包中提取的真实PLA NPLs除了轻微破坏Caco-2/HT29细胞屏障外，未表现出其他细胞毒性效应[3]。真实的PET NPLs不会产生毒性作用，但能在溶酶体类似液体中持续存在，并有效穿过重组的肠道上皮[16]。它们还能刺激线粒体呼吸并促进氧化磷酸化产生的ATP生成[17]。此外，Bhas 42细胞转化实验中还报道了PET NPL的致癌潜力[12]。
迄今为止发表的大多数研究都是在体外肠道模型上进行的，这些模型代表健康个体，并且暴露于原始状态的MNPs。实际上，人类接触的塑料大部分是在进入体内之前就已经在环境中降解的。我们最近的研究表明，人工模拟的环境降解过程会导致PET和PLA NPLs释放寡聚物[18]，这可能增加了它们的毒性，从而强调了评估原始状态和降解状态NPLs影响的重要性，以便全面了解它们对人类健康的潜在影响。
本研究的目的是评估体外肠道模型（代表健康个体或具有克罗恩病遗传易感性的人群）对原始状态及环境降解后的PET和PLA NPLs的反应。为此，我们使用了转染了野生型核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2WT）或NOD21007fs突变的Caco-2细胞，这些细胞与分泌黏液的HT29-MTX细胞共培养[26]。NOD2突变与克罗恩病有关[19]，约30-40%的克罗恩病患者至少携带该基因的一个突变[20]。NOD2是一种能够识别细菌细胞壁中的胞壁二肽（MDP）的蛋白质，通过激活NF-kB和MAPK信号通路引发炎症[21]。NOD2的1007fs突变会导致NOD2蛋白截短，失去识别MDP的能力，进而无法激活NF-κB信号通路[23]。本研究探讨了在环境相关条件下，一种可生物降解的NPL（PET）和一种不可生物降解的NPL（PLA）的体外肠道毒性。同时，通过比较易感和非易感体外模型的暴露结果，评估了克罗恩病遗传易感性对肠道敏感性的影响。
PLA颗粒（CAS编号26100-51-6），直径分别为120纳米、200纳米和450纳米，有非荧光和黄绿色荧光两种类型，购自Adjuvatis（法国里昂）。真实的PET颗粒（CAS编号25038-59-9）取自水瓶，用于本文描述的所有物理化学特性和毒性测试（Villacorta等人，2022年），这些颗粒被标记了iDye Pink以观察细胞内吞作用和积累情况[24]
原始状态及老化后的PET和PLA NPs的物理化学特性
原始状态和老化后的PLA和PET NPLs均通过透射电子显微镜（TEM）进行了成像（图1A-H）。无论直径如何，原始状态的PLA NPLs均为球形且大小均匀，存在轻微差异（图1A-C）。TEM图像显示，其平均直径略小于供应商提供的数值：113纳米而非120纳米，185纳米而非200纳米，374纳米而非450纳米。相比之下，原始状态的PET颗粒呈现为纳米级颗粒的密集聚集体（图1）
最近关于人类通过受污染的水和食物摄入MNPs的估计引发了人们对塑料颗粒对肠道整体毒性的担忧。然而，迄今为止，PET和PLA的毒性仍鲜有研究。本研究为PET和PLA NPLs对两种体外人类肠道上皮模型的影响提供了新的见解，这两种模型分别代表具有克罗恩病遗传易感性和无易感性的人群。
本研究提供了关于原始状态及环境降解后的PET和PLA NPLs在体外模型中对健康个体和具有克罗恩病遗传易感性人群的肠道毒性的宝贵数据。尽管有证据表明这些颗粒会被细胞内吞，但在所使用的暴露条件和特定细胞模型中，除PET颗粒外，未观察到任何毒性效应
Marie Carrière：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、方法论制定、概念构思。
Verane Bard：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计、数据分析。
Jacques-Aurélien Sergent：撰写、审稿与编辑、结果验证、项目监督、方法论制定、概念构思。
Thierry Douki：撰写、审稿与编辑、数据可视化、结果验证、项目监督、方法论制定。
作者声明没有需要披露的利益关系。
本研究是在PLASTOX项目框架下进行的，该项目获得了法国国家研究机构（ANR）的资助（PLASTOX项目编号ANR-21-CE34-0028-02）、法国国家环境与卫生安全局（ANSES）的资助（EXMINA项目编号PNR EST-21-077），以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助（项目编号965196，项目名称PLASTICHEAL）。
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
本项目得到了MuLife成像设施和CEA流式细胞术设施的支持，这些设施由格勒诺布尔阿尔卑斯大学化学生物学研究生院（GRAL项目，编号ANR-17-EURE-0003）资助。研究还利用了格勒诺布尔Instruct-ERIC中心（ISBG；UAR 3518，隶属于CNRS、CEA和EMBL）的电子显微镜设施，该设施得到了法国综合结构生物学基础设施（FRISBI；编号ANR-10-INSB-05-02）和GRAL项目的支持。
