乳植酸杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）中维生素B2的过量生产：关于核糖开关（riboswitch）中FMN依赖性调控机制的新见解

《Food Bioscience》：Vitamin B 2 overproduction in Lactiplantibacillus plantarum: new insights in the FMN-dependent regulatory activity of the rib operon riboswitch

益生菌封装技术研究中，采用羧甲基壳聚糖-原花青素-钙离子自组装金属酚网络（CMCS-EA-Ca2?）对乳杆菌进行单细胞封装，显著提升其耐胃酸（pH 2.0）、胆盐及低温的存活率（-20℃储存180天存活率＞6.0 log CFU/g），并成功应用于功能性冰淇淋开发。

　　

刘琦|杜静|匡红|王月|郭天琦|刘国荣

北京工商大学食品与健康学院，北京，100048，中国

摘要

益生菌对人类健康至关重要，但它们在食品加工和应用过程中的低存活率仍然是一个需要解决的重大挑战。在这项研究中，羧甲基壳聚糖-鞣花酸接枝物（CMCS-EA）和Ca²⁺自组装形成了金属-酚网络（MPN）。然后使用MPN有效封装了厌氧菌（Bifidobacterium animalis亚种animalis BB04），旨在显著提高其对抗恶劣环境条件（如胃酸、胆盐和低温）的能力及其益生菌特性。结果表明，MPN表现出优异的耐胃酸降解性，有效保护了B. animalis亚种animalis BB04免受胃酸、胆盐和低温的损害，从而显著提高了其存活率，并表现出更好的细胞粘附能力。基于此，将封装的B. animalis亚种animalis BB04添加到了益生菌冰淇淋中。BB04@CMCS-EA-Ca²⁺不仅显著降低了冰淇淋的膨胀率和融化率，更重要的是，在-20°C下储存180天后，保持了B. animalis亚种animalis BB04的活力，使其活菌计数始终高于6.0 log CFU/g。这项研究不仅提供了一种高效且多功能的封装策略来传递高活力的益生菌，还展示了其在开发稳定的冷冻益生菌功能性食品方面的巨大应用潜力。

引言

益生菌是在足够摄入量下能够促进宿主健康的活微生物（Sanders等人，2019年）。乳酸菌（LAB），尤其是厌氧菌，在加工、运输和储存过程中会受到多种不利条件的影响，包括低pH值、高温和氧气（Peruzzolo等人，2025年）。为了提高LAB的存活率，通常采用多细胞封装技术来保护益生菌免受环境压力的影响。在多细胞封装中，大量益生菌细胞被作为一个统一的整体进行封装（Yuan等人，2024年）。这种策略在可扩展性和生产简便性方面具有实际优势。然而，这种方法存在固有的局限性，包括封装效率低以及暴露于加工引起的外部有害压力（如低pH值、高温、冷冻应力），导致益生菌颗粒过大、形状可控性差、易泄漏等问题（Zhao等人，2024年）。这些局限性突显了需要更精确和高效的封装策略来更好地保护并控制益生菌的释放。

在这种背景下，食品纳米技术成为益生菌封装的强大工具，为解决与益生菌稳定性相关的挑战提供了有希望的策略。单细胞封装使用纳米胶囊、纳米乳液、纳米脂质体和纳米颗粒等方法在单个益生菌上创建纳米级涂层。Pan等人（2022年）证明，由单宁酸（TA）和铁离子（Fe³⁺）形成的金属多酚网络（MPN）的单细胞封装结构可以有效保护益生菌免受抗生素的侵袭。Liu等人（2023年）研究指出，将单个益生菌封装在玉米醇溶蛋白纳米颗粒（ZNP）和果胶的复合材料中，由于果胶层的保护作用以及ZNP的稳定性提升，提高了益生菌的耐热性。Feng等人（2020年）使用阴离子肠聚合物L100-55进行单细胞封装，以保护Escherichia coli Nissle 1917（EcN）免受消化道环境的影响。因此，单细胞封装不仅能够为单个细胞提供纳米级保护涂层，还能有效提高益生菌的存活率，保护它们免受不良环境条件的影响。

在各种单细胞封装方法中，MPN因其易于自组装、多功能性和生物相容性而脱颖而出，成为封装益生菌和生物活性化合物的广泛采用的平台（Wang等人，2022年）。含有儿茶酚官能团的酚类化合物普遍存在，并以其多样的金属螯合能力而著称（Ju等人，2015年）。多酚和金属离子的协同组装形成了MPN。然而，MPN在低pH条件（pH < 3.0）下稳定性有限，主要是由于质子导致金属离子和酚类配体之间的配位键解离（Xia等人，2024年）。MPN对低酸性环境的敏感性仍然是提高益生菌生物利用度的主要障碍。MPN的形成依赖于多酚和金属离子之间的配位键。这种不稳定性源于在低pH下质子（H⁺）对酚类配体的竞争性结合，破坏了金属-酚酸盐的配位。这种酸诱导的解体损害了MPN涂层的结构完整性，严重限制了其在恶劣胃肠道环境中保护封装益生菌的能力。

最近，基于MPN的几种创新单细胞封装策略被提出以提高益生菌的存活率（Xie等人，2025年）。例如，通过逐层自组装TA-Ca²⁺复合物和黏蛋白，使用EcN作为模型菌株，创建了“超级益生菌”，保护益生菌免受恶劣胃肠道环境的影响并提高了存活率（Yang等人，2022年）。同样，Xie等人（2025年）将Fe³⁺固定在EcN表面，通过与TA的自组装形成MPN壳，然后沉积羧甲基β-葡聚糖来构建装甲益生菌，从而在低温条件下提高益生菌的存活率。Zhu等人（2024年）报告称，通过在细菌表面构建透明质酸功能化的金属-酚网络涂层，提高了益生菌在恶劣胃肠道环境中的存活率。这些方法，特别是后者添加了独特的多糖层，体现了“二次涂层”策略。这种范式依赖于对益生菌细胞的外部强化，通常涉及多步骤过程，并可能引入影响生物相容性的界面。更重要的是，这些方法并没有从根本上解决保护涂层在恶劣条件（如酸性胃肠道环境）下的脆弱性问题。任何基于MPN的封装的有效性都取决于金属-酚配位网络的内在稳定性，尤其是在酸性条件下。常见的提高MPN酸稳定性的策略包括应用二次物理涂层和筛选更稳定的多酚-金属对（Wasuwanich等人，2022年）。虽然这些方法有益，但它们主要关注外部添加或现有化学空间内的选择，可能无法完全解决核心稳定性问题。因此，我们提出了从“外部强化”到“内部核心增强”的范式转变。我们直接在分子水平上工程化了主要的配位配体（Xu等人，2022年）。

从健康百岁老人的粪便中分离出的Bifidobacterium animalis亚种animalis BB04被发现能产生多种代谢物，并在食品保存中表现出显著的益生菌特性。然而，作为一种专性厌氧菌，这种菌株对加工和储存非常敏感，严重限制了其实际应用。为了克服这些限制，我们提出了一种更简化且本质上更稳定的方法：将多酚共价接枝到羧甲基壳聚糖（CMCS）上。这种设计的目的是在分子水平上增强MPN核心的耐酸性，利用CMCS作为成熟的封装材料的优势，同时避免额外涂层的需要。在此，开发了一种新型的自组装细胞涂层来提高B. animalis亚种animalis BB04的活力和稳定性，并探索其在益生菌冰淇淋中的应用。首先，将CMCS与五种多酚接枝以增强稳定性。随后制备了B. animalis亚种animalis BB04的单层纳米涂层（BB04@CMCS-EA-Ca²⁺）。进一步评估了BB04@CMCS-EA-Ca²⁺的益生菌特性和环境耐受性。最后，在冰淇淋模型中评估了BB04@CMCS-EA-Ca²⁺的关键性能属性，包括加工抗性、冷藏稳定性和模拟胃肠道消化耐受性。这项研究提供了一种在酸性条件下增强MPN稳定性的新方法，为提高Bifidobacterium在各种恶劣环境中的存活率以及开发新型功能性食品提供了新的见解。

材料

单宁酸（TA）、鞣花酸（EA）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）从Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）购买。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、（?）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、原儿茶酸（PCA）、没食子酸（GA）、羧甲基壳聚糖（CMCS）和胆盐从Macklin Biotechnology Co., Ltd.（上海，中国）采购。氯化钙（CaCl₂）和氯化钠（NaCl）从Fuchen Co.购买。

多酚化合物的MPN形成能力分析

MPN的一个明显局限性是在低pH环境（pH < 3.0）下的不稳定性（Xia等人，2024年），这可能导致快速的结构崩解，使益生菌暴露在恶劣环境中，并导致益生菌存活率显著下降。在这项研究中，为了提高MPN的稳定性，通过将其与CMCS接枝来修饰选定的多酚。修饰的目标是五种多酚：单宁酸（TA）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、没食子酸（GA）

结论

在这项研究中，开发了一种用于B. animalis亚种animalis BB04单细胞封装的新金属-酚网络（CMCS-EA-Ca²⁺。通过SEM和TEM确认了BB04@CMCS-EA-Ca²⁺的成功制备。封装的益生菌表现出对低温、氧气、胃肠道转运和胆盐的增强抗性，以及由于保护性交联基质对细胞的屏蔽作用而改善的细胞粘附性。

CRediT作者贡献声明

刘琦：撰写——原始草稿，数据管理，概念构思。杜静：撰写——原始草稿，数据管理，概念构思。匡红：形式分析。王月：可视化。郭天琦：研究。刘国荣：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。

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• 1.
  引言和目的

益生菌冰淇淋感官评估的核心目的是系统地评估产品的感官质量是否符合消费者的

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

该项目由北京自然科学基金（编号：6252001）和中国自然科学基金（编号：31871772）资助。