关于CaCl2浓度调控大豆蛋白纤维化过程的机制性研究：纤维化动力学、纤维形态及肽组成

《Food Hydrocolloids》：Mechanistic insights into soy protein fibrillation regulated by CaCl 2 concentration: Fibrillation kinetics, fibril morphology, and peptide composition

钙离子强度通过调控大豆蛋白纳米纤维（SPNF）的形态、结构和肽组成影响其形成动力学。实验表明，100 mM CaCl2促进SPNF快速生长，形成柔韧纤维且β-折叠含量最高；200-300 mM时纤维变硬且核心肽比例上升，提示离子强度通过盐析-like机制调控纤维组装。研究揭示了离子强度与纤维特性间的关联，为功能蛋白材料开发提供新机制。

　　

赵赫凯|黄玉阳|齐宝坤|李阳

中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学食品科学学院，邮编150030

摘要

氯化钙可以显著增强大豆蛋白纳米纤维（SPNF）的结构特性；然而，CaCl₂诱导的离子强度对纤维化过程的调控作用及其潜在机制仍需进一步阐明。在本研究中，系统地探讨了不同CaCl₂浓度（0–300 mM）下SPNF的纤维化动力学、形态、构象特征和肽组成。凝胶电泳、粒径分析及Thioflavin T荧光实验表明，随着CaCl₂浓度的增加，蛋白质水解速率加快，而纤维生长速率在100 mM时达到最大值，随后由于大聚体的形成而下降。原子力显微镜观察发现，在较低的CaCl₂浓度（≤ 100 mM）下，柔性纤维随着盐浓度的增加和孵育时间的延长而延长，24小时后形成缠结的成熟纤维。相反，在200和300 mM的CaCl₂条件下形成了刚性纤维，这些纤维的轮廓长度减小但持久长度增加。傅里叶变换红外光谱显示，尽管在100 mM CaCl₂时纤维系统的β-折叠含量最高，但在200 mM时分离出的纤维组分显示出更高的β-折叠含量。陷阱离子迁移谱和飞行时间质谱进一步证实，200 mM条件下形成的刚性纤维含有较短的肽序列，并且纤维形成肽中核心肽的比例较高，表明核心序列在纤维化过程中发挥了更大的作用。本研究建立了盐浓度、纤维形态和纤维肽组成之间的潜在联系，推进了对离子强度调控大豆蛋白纤维化过程的理论理解。

引言

蛋白质分子在外部因素的影响下会发生多维聚集，这赋予它们在食品加工中的优良功能特性（Nicolai & Durand, 2013）。三维聚集形成填充空间的网络，改变体系的流变性质；而二维界面聚集则增强乳液和泡沫的稳定性（Nicolai et al., 2013）。最近的研究发现，由食品来源蛋白质通过一维定向组装形成的蛋白质纤维聚集体显著增强了这些多维聚集所产生的功能特性（Meng, Wei, & Xue, 2022）。由于蛋白质纤维具有较高的长宽比和柔韧性，它们不仅显著提高了低体积分数溶液系统的粘度和凝胶化程度，还在界面处表现出极高的脱离能量，进一步抑制了两相界面的不稳定（Yue et al., 2022）。值得注意的是，虽然食品来源的纤维具有与病理淀粉样纤维相似的交叉β结构，但它们不会引发淀粉样病的致病性，并保留了天然蛋白质的营养价值（Rahman et al., 2023; Xu et al., 2023）。因此，蛋白质纤维化已成为开发新型食品成分和生物相容性材料的有前景的方法。

植物蛋白因其低成本和可持续性而受到重视，已成为设计食品来源纤维的重要来源。然而，其紧凑的球形结构阻碍了纤维化过程，因为这些结构掩盖了纤维形成所需的自互补序列（Cao & Mezzenga, 2019）。因此，酸热处理（pH < 2.5, T > 80 °C）被广泛认为是实现植物蛋白有效纤维化的先决条件，这种处理可以展开蛋白质并释放纤维形成肽（Lambrecht et al., 2019; Zheng, Gao, Chang, Sun, & Fang, 2023）。大豆蛋白作为最优质的植物蛋白之一，含有丰富的酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸），这些氨基酸在酸热处理下促进快速水解和组装，使其具有强烈的纤维化倾向（Ji et al., 2023）。与天然大豆蛋白相比，大豆蛋白纳米纤维（SPNF）表现出更优的凝胶化和乳化性能，在铁强化、生物支架和可持续包装等应用中具有巨大潜力（Wei et al., 2023; Xiang, Wu, Wei, Shao, & Sun, 2021; Yuan et al., 2025）。然而，纤维的功能特性与其结构和形态密切相关（Hoppenreijs et al., 2022），因此有效调控大豆蛋白的纤维化过程对于提升其功能性能和扩大应用范围至关重要。

蛋白质的纤维化行为主要受其内在结构特征和孵育参数的控制。因此，物理处理（如超声波、微波和脉冲电场）以及环境参数（如pH值、温度和离子强度）的调整已被广泛用于调控纤维化过程（Cao & Mezzenga, 2019）。其中，离子强度通过静电屏蔽、盐桥接和特定离子效应调节纤维形成肽之间的相互作用，从而在调控纤维特性方面发挥关键作用（Loveday, Su, Rao, Anema, & Singh, 2012）。Li等人（2021）报告称，50 mM NaCl促进了米谷蛋白纤维的延长，而150 mM NaCl虽然提高了生长速率，但产生了较短的纤维。Wang等人（2025）发现亚麻籽蛋白纤维在NaCl浓度增加时从刚性结构转变为柔性结构，且柔性纤维由较短的肽组成。值得注意的是，离子的加入有可能协同构建功能性材料，如纤维铁强化剂和功能性涂层（Saif, Zhang, Zhang, Gu, & Yang, 2019; Zhou et al., 2025）。先前的研究表明，在相同摩尔浓度下，二价CaCl₂比单价NaCl更有效地增强了纤维的结构有序性和轮廓长度，并显著提高了其热稳定性（Zhao, Xu, Yuan, Qi, & Li, 2024; Zhao, Lu, Huang, Qi, & Li, 2026）。因此，使用CaCl₂来调控大豆蛋白的纤维化特性有助于扩大其应用范围，并进一步放大特定离子效应对纤维化过程的影响（Loveday et al, 2010）。尽管已有文献记录了CaCl₂浓度对SPNF生长、聚集和抗氧化特性的影响（Miao et al., 2023），但CaCl₂调控大豆蛋白纤维化的具体调控模式和机制仍不明确。

因此，本研究采用不同浓度的CaCl₂（0–300 mM）系统分析其对纤维化动力学、纤维形态、结构和肽组成特性的调控作用。更重要的是，本研究采用了一种新的视角，强调通过类似盐析的聚集作用来区分高浓度CaCl₂引起的形态转变。纤维化动力学和形态演变通过凝胶电泳、Thioflavin T（Th T）荧光和原子力显微镜（AFM）进行监测。纤维内的构象转变通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和广角X射线衍射（WAXS）进行表征。纤维形成肽和纤维核心肽通过超滤离心法分离，并利用陷阱离子迁移谱和飞行时间质谱（TIMS-TOF-MS）进行鉴定。这项工作为调控大豆蛋白纤维形成的离子强度依赖机制提供了新的见解。

材料

使用成熟大豆（Dongsheng-10品种；粗蛋白含量：40.02%）通过碱溶解-酸沉淀法提取大豆蛋白分离物（SPI）。Thioflavin T（Th T）、二硫苏糖醇（DTT）和吲哚-3-乙酸（IAA）购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。Pierce C18 Tip（20 μL）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。胃蛋白酶（产品编号10108057001）、胰蛋白酶（产品编号T6567）和超滤管（15 mL，100

初始蛋白质的表征

环境变化（如构象展开和疏水残基的暴露）引起的初始蛋白质结构变化会显著影响其纤维化行为（Liu, Yang, Wang, Jiang, & Chen, 2024）。因此，我们首先明确了在不同CaCl₂浓度下大豆蛋白的变化。如图1A和B所示，分别测定了CaCl₂

结论

本研究表明，由于离子强度增加而导致的类似盐析的聚集在纤维化特性中起着重要的调控作用。较低浓度的CaCl₂（≤ 100 mM）促进了柔性纤维的形成，伴随着延迟阶段的缩短、生长速率的加快、轮廓长度的增加以及氢键和β-折叠含量的提高。在100 mM CaCl₂条件下，纤维的生长速率最快，转化率最高，产生

CRediT作者贡献声明

赵赫凯：撰写初稿、软件使用、方法设计、数据管理、概念构建。黄玉阳：实验研究、数据管理。齐宝坤：撰写与编辑、方法设计、实验研究、概念构建。李阳：项目监督、资源调配、项目管理

未引用参考文献

Afkhami et al., 2024; Jalali et al., 2023; Li et al., 2024; Li et al., 2021; Morris et al., 2008; Mohammadian and Madadlou, 2018; Zhao et al., 2026.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们衷心感谢重庆市自然科学基金（CSTB2023NSCQ-MSX0601）提供的财政支持。