通过噬菌体与益生菌之间的协同作用来对抗抗噬菌体的假单胞菌基尔森斯菌（Pseudomonas kielensis）变种

《Food Microbiology》：Fighting phage-resistant variants of Pseudomonas kielensis by synergistic interaction between bacteriophages and probiotic treatment

噬菌体phiPKYZU08靶向冷链食品中的腐败菌假单胞菌Kielensis PK-YZU08，其短尾二十面体头部结构及43,378bp基因组具有81.18%与噬菌体phiNV3同源性。但长期使用出现耐药菌株，其生物膜形成能力增强。联合乳酸杆菌LP03提取物（6.25%-100%）与phiPKYZU08（10^6 PFU/mL）可协同抑制细菌增殖，12h完全抑制，48h最低抑菌率达79.06%。协同机制包括直接杀菌、抑制生物膜形成及阻断耐药菌株进化。该多靶策略为食品工业防控假单胞菌提供了新方案。

　　

袁蕾|吴凤宇|陈超伟|唐安琪|徐舒|陈飞|杨振权

扬州大学食品科学与工程学院，中国扬州225127

摘要

Pseudomonas kielensis是一种已知会导致食品腐败的嗜冷细菌。噬菌体已被证明是抑制食品行业中腐败细菌生长的有希望的替代品。本研究分离并鉴定了一种针对Pkielensis的新溶菌性噬菌体phiPKYZU08。属于Autographiviridae家族的phiPKYZU08噬菌体具有较短的尾部（16.05纳米）和二十面体头部（49.85纳米），其裂解效率为226 PFU/细胞，潜伏期为10分钟，裂解期为30分钟。该噬菌体的双链DNA基因组长度为43,378 bp，包含52个开放阅读框（ORFs），与Pseudomonas agarici噬菌体phiNV3的基因组有81.18%的同源性，但不含有毒力或抗生素抗性基因。然而，在噬菌体处理后观察到了抗性菌株，这些抗性菌株表现出更强的生物膜形成能力。RNA测序结果显示，与能量代谢相关的12条KEGG通路上调，而戊糖磷酸途径、硫代谢和ABC转运蛋白通路显著下调。为了克服噬菌体抗性，将Lactiplantibacillus plantarum LP03提取物（浓度范围为12.5%至100%）与噬菌体phiPKYZU08（10⁶ PFU/mL）联合使用，对Pkielensis PK-YZU08的再生表现出协同作用，在处理12小时、24小时和48小时后完全抑制了细菌生长。即使是最低浓度的Lplantarum LP03提取物（6.25%）与噬菌体phiPKYZU08联合使用，在48小时时仍保持了79.06%、24小时时71.63%、12小时时56.60%的抗菌效果。这种协同机制通过三条主要途径实现：（1）直接的抑菌活性以抑制细菌生长；（2）抑制生物膜形成以破坏细菌群落完整性；（3）抑制对噬菌体不敏感的突变体以减缓抗性进化。总体而言，这种多靶点策略为食品工业中控制Pseudomonas提供了一种创新且有效的方法。

引言

Pseudomonas属表现出显著的代谢多样性，是系统发育上变化最大的菌属之一，截至撰写本文时约有351个有效物种（https://lpsn. dsmz.de/genus/pseudomonas）。该属的成员具有良好的环境适应性，能够定殖从空气到土壤、水以及不同来源的食品样本等多种生态位（Alexandre等人，2025年）。Pseudomonas kielensis最初从德国的原料牛奶中分离出来，并被鉴定为Pseudomonas属的一个新物种，是冷链食品腐败的主要致病菌（Gieschler等人，2021年）。Pseudomonas菌株的危害性源于其独特的低温适应性和产生耐热酶的能力，这些酶会通过产生异味、颜色缺陷和苦味等途径对食品质量产生不利影响（Dou等人，2025年；Yuan等人，2025b年）。

Pseudomonas物种在食品加工过程中还带来了另一个重大挑战，因为它们能够在各种食品接触表面形成强生物膜，而且在冷藏温度（4-10°C）下形成的生物膜生物量和细胞外基质比在正常条件下更高（Liu等人，2023年）。这些成熟的生物膜对常规的物理和化学消毒方法具有很强的抵抗力（Dai等人，2024年；Liu等人，2023年；Mgomi等人，2025年）。处于生物膜状态的Pseudomonas分离株通常产生的蛋白酶量比浮游细胞更多（Teh等人，2012年）。此外，Pseudomonas的存在不仅能够促进其他食源性病原体在混合生物膜中的形成，还能保护这些病原体免受极端温度、抗菌剂和pH值波动等不利条件的影响（Zhou等人，2024年；Zarei等人，2023年）。作为食品加工设备上的持续微生物库，Pseudomonas生物膜成为食品工业中安全和质量问题的持续污染源。这些显著影响凸显了开发针对Pseudomonas的新颖有效控制策略的迫切需求。

天然策略，如噬菌体、精油、益生菌和有机酸，被认为是减少Pseudomonas引起的食品腐败的有效方法（Dai等人，2024年；Mgomi等人，2021年；Ding等人，2025年；Chen等人，2024年）。

与传统化学杀菌剂或抗生素相比，噬菌体已成为减少易腐食品中细菌负荷的有希望的替代品。先前的研究广泛报道了噬菌体在减少食品中细菌负荷、控制Pseudomonas生长和传播以及降低Pseudomonas在食品工业中造成的风险方面的作用（Yuan等人，2025c年；Ming等人，2025年；Mgomi等人，2021年）。例如，属于Podoviridae家族的噬菌体UFJF_PfSW6和UFJF_PfDIW6在4°C下将牛奶中的P. fluorescens数量减少了3.2 Log CFU/mL（do Nascimento等人，2022年）。噬菌体YZU_PF006有效抑制了P. fluorescens的生长，并以浓度依赖的方式抑制了其蛋白酶的产生，从而减轻了随后的食品腐败，包括pH值下降、颗粒大小增加、苦味氨基酸的形成和酪蛋白的水解（Yuan等人，2025b年）。然而，Pseudomonas的广泛表型和基因型多样性成为噬菌体生物控制广泛应用的主要瓶颈，因为其宿主范围相对较窄（Ming等人，2025年；Yuan等人，2025c年）。值得注意的是，迄今为止，针对Pkielensis并控制其在食品工业中污染的噬菌体研究还非常有限。

然而，噬菌体抗性变异体的出现构成了基于噬菌体干预的主要障碍，限制了噬菌体在食品工业中的长期效果和可扩展性。早期研究表明，噬菌体抗性可以迅速发展并在食品加工环境中持续存在，反复使用噬菌体会产生选择压力，从而放大抗性亚群（Ge等人，2022年）。例如，在30^oC下，以100的MOI处理噬菌体后，2小时内Listeria monocytogenes的活细胞数量减少了1.4 Log，但在24小时后细胞数量又恢复到初始水平（Maung等人，2024年）。细菌已经进化出多种逃避噬菌体感染的策略，包括阻止噬菌体吸附到细胞表面、介导超感染排斥以防止二次噬菌体入侵、激活限制-修饰系统降解噬菌体DNA、利用CRISPR-Cas系统进行序列特异性噬菌体基因组靶向、触发中止性感染以牺牲受感染细胞并限制噬菌体传播以及诱导群体感应（Georjon和Bernheim，2023年）。

相比之下，采用物理、化学和生物技术的联合抗菌方法被推荐为控制由噬菌体抗性变异体引起的细菌污染的有效手段（Zou等人，2022年；Costa等人，2024年）。作为具有天然抑菌活性的益生菌，乳酸菌（LAB）的抗菌特性在食品保存和防止致病菌及腐败菌方面引起了广泛关注（Wang等人，2019年）。其拮抗机制包括代谢物抑制、竞争性排斥和群体感应干扰。在LAB代谢物中，有机酸通过降低环境pH值破坏细菌膜完整性，而螯合金属离子则抑制关键酶活性。同时，抗菌肽通过特定的分子识别机制靶向微生物细胞结构（Pang等人，2022年）。鉴于Pseudomonas在工业环境中形成的生物膜及其导致的巨大经济损失，将LAB及其提取物与噬菌体疗法结合使用提供了一种可持续的控制方法。然而，目前对这项技术的理解仍然非常有限，许多关键研究问题尚未得到解决。

在这项研究中，从中国扬州收集的污水样本中分离出一种针对P. kielensis的新溶菌性噬菌体phiPKYZU08。分析了phiPKYZU08的生物学特性、基因组特征及其在食品模型中的抑制效果。在噬菌体应用过程中观察到了P. kielensis PK-YZU08的抗性突变体，并通过表型和转录组分析探讨了P. kielensis的噬菌体抗性机制。为了克服这一限制，探索了LAB提取物与噬菌体联合使用对P. kielensis PK-YZU08的协同作用。这些发现可以为控制冷链食品中的P. kielensis提供理论和技术支持，从而减轻由微生物腐败引起的食品质量下降和经济损失。

部分内容片段

细菌菌株和生长条件

宿主Pkielensis PK-YZU08和益生菌菌株Lactiplantibacillus plantarum LP03分别从腐败的鱼产品和泡菜样本中分离并鉴定。菌株的鉴定依据了先前的研究方法（Xu等人，2014年；Gu等人，2017年）。简要来说，使用DNA提取试剂盒（AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit，Axygen，中国）提取了细菌DNA。使用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因

P. kielensis噬菌体的分离和鉴定

噬菌体作为针对病原体和腐败细菌的生物控制剂受到了越来越多的关注。先前的研究报道了噬菌体在控制Pseudomonas污染引起的食品腐败方面的应用（Yuan等人，2025b年；Qin等人，2024年）。然而，Pseudomonas在自然环境中的广泛表型和基因型多样性限制了针对该属新鉴定物种的噬菌体的应用。

在这项研究中，分离出一种新的

结论

本研究提供了一种针对Pkielensis PK-YZU08的新噬菌体phiPKYZU08，该噬菌体具有良好的稳定性和抗菌活性，但在长时间处理后仍观察到了抗性菌株。抗性菌株表现出更强的生物膜形成能力，这对食品工业来说是一个潜在的挑战。为了解决这个问题，本研究还建立了一种基于噬菌体和益生菌的治疗方法，这项技术代表了根除P. kielensis的有效策略

CRediT作者贡献声明

袁蕾：撰写——初稿，实验研究。吴凤宇：实验研究，数据分析。陈飞：撰写——审稿与编辑。杨振权：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取。徐舒：资源提供，项目管理。陈超伟：数据分析，数据管理。唐安琪：软件使用，数据管理

未引用参考文献

Chen等人，2024年；Majdani和Ghahfarokhi，2022年；Titze和Kr?mker，2020年；Wang等人，2020年；Yuan等人，2020年；Yuan等人，2020年。

利益冲突声明

所有作者声明没有利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

所有作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32372368、32302953）、中国博士后科学基金（2021TQ0274、2022M720120）、扬州大学的“青兰”人才支持计划以及江苏农业集团有限公司南通分公司的餐饮食品联合发展基金的支持。