《International Dairy Journal》：Conformational remodeling of α-Lactalbumin by glycyrrhizin under acidic pH for enhanced emulsion stabilization: Unravelling the mechanisms by integrated experimental and computational approaches
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α-乳清蛋白与甘草酸在酸性条件下的协同乳化机制研究，通过实验和分子动力学模拟发现pH 2.0-7.0调控蛋白构象与静电作用，形成更稳定的复合物，显著降低乳滴尺寸，增强抗 creaming 和抗离心能力。关键因素包括氢键网络重塑、疏水相互作用增强及溶剂可及性改变。
作者：史瑞杰 | 高增利 | 元丽霞 | 李宁 | 江占梅 | 穆志深
内蒙古蒙牛乳业（集团）有限公司国家企业技术中心，中国呼和浩特市 011500
摘要
本研究探讨了酸性pH值（范围从7.0到2.0）对α-乳白蛋白（α-La）与甘草苷（Gy）相互作用的影响，以及这种影响对乳液稳定性的作用。综合实验结果和分子动力学（MD）模拟表明，由羧基质子化引发的α-La结构展开破坏了氢键网络和主链二级结构。甘草苷的存在促进了β-折叠片的形成，减少了无规卷曲结构的比例，并通过疏水作用和氢键作用增强了结构的刚性。因此，乳化性能显著提高，α-La–Gy复合物表现出更小的液滴尺寸、更高的ζ电位值，以及更强的抗乳化分层、离子强度和离心应力能力。尽管DLVO理论分析表明在等电点附近由于静电排斥力不足会导致颗粒聚集，但甘草苷有效恢复了静电排斥力，并在高度酸性条件下提供了额外的空间稳定作用。MD模拟还证实，在低pH值下溶剂可及性增加，油水界面吸附增强。主成分分析确定ANS结合、氢键作用和溶剂可及表面面积是关键的稳定性因素。这些发现为设计基于蛋白质的乳化剂提供了分子层面的见解，对于稳定酸化乳制品（如酸奶饮料和强化乳制品）具有重大潜力。
引言
基于乳液的食物（如牛奶饮料、涂抹酱和酱料）由于油滴的高表面积而本质上具有热力学不稳定性，这会导致聚集、合并和相分离（McClements等人，2007；Zhang、Feng和Zhang，2018）。通常使用乳化剂（包括蛋白质（例如乳清蛋白、大豆蛋白）或小分子表面活性剂（例如吐温、卵磷脂）来降低界面能并在液滴周围形成保护层（Cai等人，2023；Fan等人，2022）。然而，消费者对清洁标签和天然成分的需求增加推动了研究向生物相容的、基于植物的合成表面活性剂替代品的发展。在这种情况下，天然生物聚合物和生物表面活性剂的协同组合为开发高性能乳化剂提供了有前景的策略（Derkatch等人，2007；de Faria等人，2017；Marhamati、Ranjbar和Rezaie，2021）。特别是基于蛋白质-皂苷的乳化剂因其能够结合蛋白质的优异成膜性能和粘弹性以及天然皂苷的高表面活性和固有的空间稳定能力而受到广泛关注。这种协同作用弥补了各组分的局限性：皂苷促进快速界面吸附并提供静电或空间排斥力，而蛋白质则作为结构支架，形成具有增强机械强度的致密弹性界面膜，从而提高乳液和泡沫的稳定性（Li等人，2023）。
蛋白质-皂苷系统中的结合和共吸附行为主要由非共价相互作用控制，包括疏水作用、氢键作用和静电作用（Li等人，2023；Kezwon和Wojciechowski，2014）。皂苷的疏水苷元倾向于与蛋白质表面的非极性区域或其疏水核心相互作用，而糖基部分可以与极性蛋白质残基形成氢键。这些相互作用对环境条件（特别是pH值）非常敏感，pH值会调节两种组分的电离状态、蛋白质构象、净电荷以及静电吸引或排斥（Idrees等人，2017；Waseem等人，2022）。这种pH依赖性为合理设计具有定制功能的复合物提供了关键机会。为了满足消费者对天然和健康成分的需求，乳清蛋白因其优异的营养价值和功能特性而受到广泛关注（Hao等人，2025）。其中，α-乳白蛋白（α-La）是一种小的钙结合球状蛋白，具有明确的疏水结合口袋，能够与多种生物活性化合物相互作用，使其成为与疏水配体形成复合物的理想候选者（Shi等人，2024）。甘草苷（Gy）是从甘草根（Glycyrrhiza glabra）中提取的天然三萜皂苷，具有典型的两亲结构，包含疏水的甘草酸苷元和亲水的葡萄糖醛酸二糖链，能够在油水界面有效吸附（Rai等人，2021；Taarji等人，2021）。
基于对pH敏感的相互作用已有理解，我们假设酸性pH值作为α-La-Gy系统的精确“分子触发器”。然而，关于酸性pH值（从温和到极端）如何精确调节α-La与Gy之间的相互作用、由此产生的构象动态以及与宏观乳液稳定性的因果关系，目前仍知之甚少。此外，关于这种pH定制复合物的界面行为的原子级见解仍然缺乏。因此，阐明这种pH依赖机制对于合理设计基于蛋白质-皂苷的乳化剂至关重要。分子动力学（MD）模拟是一种强大的工具，可以原子级别研究此类界面现象和分子相互作用，已广泛应用于研究蛋白质折叠、表面活性剂吸附和界面上的生物分子行为（Goodarzi和Zendehboudi，2019；Jia等人，2024；Munusamy等人，2018）。最近的研究利用MD模拟成功研究了卵白蛋白在空气-水界面的吸附（Jin等人，2022）、甘油酸在zein-Tween20稳定乳液中的分布（Chen、Wang和Xiao，2024），以及hydrophobin在油/水界面的取向和构象变化（Yu等人，2022），显示出其在提供补充机制见解方面的潜力。
本研究的主要目标是通过结合多尺度实验技术和计算模拟，系统地揭示酸性pH驱动的α-La与Gy相互作用及其对乳液稳定性的影响机制。通过将分子层面的结构变化与宏观功能联系起来，本研究旨在为稳定、天然的乳液系统的合理设计提供基本见解。理解这一机制对于开发清洁标签的乳制品配方至关重要，特别是对于稳定酸化的乳清饮料、酸奶奶昔及相关乳液，从而扩展乳清蛋白的应用范围。
材料
来自牛乳的α-La粉末（≥85%）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。Gy（≥99%）购自上海Macklin生化技术有限公司（中国上海）。8-苯胺萘-1-磺酸（ANS）也购自Sigma-Aldrich公司。所有其他使用的化学品均为分析级。
在不同pH值下形成的α-La-Gy复合物的制备和表征
在蒸馏水中制备了α-La溶液（5 mg/mL和2 mg/mL）和Gy溶液（5 mg/mL）。将α-La溶液的pH值调整至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0
粒径和ζ电位
粒径是评估分散系统稳定性的重要指标（Sun等人，2022）。图1a和b显示了pH值对含Gy或不含Gy的α-La粒径分布的影响。在pH 3.0和2.0时，α-La的粒径分布更均匀，而在pH 5.0和4.0时分布更宽。在pH 5.0和4.0时，加入Gy导致粒径增大，平均粒径显著增加（图1c），这归因于静电排斥力的减弱
结论
总之，本研究系统地证明了酸性pH值是增强α-La与Gy相互作用的有效策略，从而形成了具有优异乳化性能的复合物。在极端酸性条件（pH 2.0–3.0）下，α-La的结构展开暴露了疏水区域，增加了溶剂的可及性，促进了通过疏水作用和氢键作用与Gy的更强结合。这些分子层面的变化
CRediT作者贡献声明
史瑞杰：撰写 – 原稿撰写、软件使用、方法设计、实验研究、概念构建。高增利：实验研究、数据分析。穆志深：撰写 – 审稿与编辑、监督。元丽霞：实验研究。李宁：数据管理。江占梅：撰写 – 审稿与编辑、监督
未引用参考文献
Cornacchia等人，2014；Homeyer和Gohlke，2012；Li等人，2022；Shi等人，2024。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国博士后科学基金会（项目编号：2023M741834）和聊城大学的博士研究项目（项目编号：318052261）的支持。
