《Reproductive Biology》：Temporal characterization of conditions that promote functional capacitation of stallion sperm
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本研究通过对比不同温度和精子分离技术对马精子 capacitation 的影响，发现 ambient 温度下维持4小时可获得最佳 capacitation 效果，同时保持精子活力和顶体完整性。实验验证了冷冻精子使用微流控技术分离后，在马IVF系统中成功实现胚胎发育，为优化马匹体外受精条件提供了依据。
乔昂·D·德·阿戈斯蒂尼·洛萨诺（Joao D. de Agostini Losano）、吉莉安·E·格廷（Jillian E. Guertin）、莫拉·S·麦格劳（Maura S. McGraw）、拉娜·卡茨（Lana Katz）、维尔塞乌·博尔迪尼奥（Vilceu Bordignon）、贾斯汀·W·卡拉哈姆（Justin W. Callaham）、何塞·H·F·庞特斯（Jose H.F. Pontes）、珀尔拉·弗勒里（Perla Fleury）、马克·马塞拉蒂（Marc Maserati）、卡莉·特纳（Carly Turner）和布拉德福德·W·戴尼奥（Bradford W. Daigneault）
美国佛罗里达大学动物科学系，盖恩斯维尔，佛罗里达州
摘要
历史上，马匹的体外受精（IVF）一直面临挑战，主要是因为缺乏促进公马精子功能成熟的条件。精子的功能成熟通常需要较长时间的孵育。然而，由于对促进公马精子功能成熟条件的研究不够充分，马匹IVF技术的发展受到了阻碍。本文描述了在Percoll、Swim-Up或微流控技术（VetMotl）辅助下，促进新鲜、冷却或解冻后的公马精子功能成熟的条件。新鲜（稀释后的）精子以及之前在5°C下保存24-48小时的精子，在38°C或室温条件下孵育最多22小时后，每隔4小时检测一次其运动能力、酪氨酸磷酸化程度和顶体完整性。结果显示，在38°C下保存精子会损害其运动能力，而无论采用何种分离技术，新鲜或之前冷却过的精子在室温下保存4小时时都能达到最佳的功能成熟状态。重要的是，在4小时时检测的精子具有最高的顶体完整性。然而，在异种牛的IVF系统中，这些条件对新鲜精子的功能成熟效果不佳。解冻后的公马精子在微流控选择技术下的表现优于Swim-Up技术，体现在精子运动学、功能成熟度和顶体状态方面。受精潜力通过原核形成和极体排出得到验证。这些发现为促进公马精子功能成熟提供了宝贵的信息，有助于推进马匹IVF技术的发展。
数据可用性
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引言
在马产业中，通过辅助生殖技术（如人工授精（AI）、胚胎移植（ET）、胞浆内精子注射（ICSI）以及在有限程度上的体细胞核移植[39]来实现活体后代的商业生产。这些技术的成功应用需要考虑特定条件，尤其是对公马精子的要求，这些条件包括运动能力、存活率、功能成熟度和顶体状态[24]。尽管不同物种的精子生物学特性存在差异，但由于雌性生殖道的固有特性，这些辅助生殖技术在体内产生后代方面具有相似性。然而，由于某些未知原因，这些体外技术（如ICSI和IVF）在不同动物物种间的应用存在显著差异。在牛和人类中，IVF的成功率较高，因此可以用于临床和商业实践[14],[17]。然而，马匹的IVF技术尚未成熟，主要原因是缺乏促进精子功能成熟所需的理想条件[23]。
与马不同，公牛精子的功能成熟可以通过添加糖胺聚糖（如肝素）以及在配子共孵育过程中加入低牛磺酸、青霉胺和肾上腺素来诱导[35]。然而，公马精子似乎对这些添加剂没有反应，尝试诱导功能成熟的效果通常不可重复或效果不佳[24]。多种诱导剂（如钙离子载体、咖啡因、肝素和普鲁卡因）在马匹IVF和胚胎生产中并未显示出有效性[20],[22],[25],[31]。目前有多种方法用于检测马精子是否成熟，例如评估顶体反应、超激活、细胞内钙流入以及酪氨酸磷酸化[8]。然而，这些成熟标志物并不一定能反映精子在IVF等技术中的实际功能状态[24]。最近的研究表明，将精子在功能成熟条件下预孵育22小时后再进行配子共孵育，可以产生可存活的胚胎并导致幼驹出生[12]。在功能成熟条件下保存10小时的公马精子产生的囊胚与ICSI的结果相当[27]。同样，解冻精子在受精前的预孵育时间对囊胚产率也有影响[11]。尽管有这些关于马匹体外囊胚生产的最新报告，但目前仍缺乏关于新鲜、冷却和解冻精子功能成熟条件的明确信息[13],[21]。相比之下，马匹的ICSI技术虽然有效，但在牛中的成功率较低[3],[15]。IVF和ICSI成功率之间的差异反映了物种特异性精子生物学的细微差别，这些差异限制了这些技术的应用和推广。
体外胚胎生产（IVP）在人类和牛中已趋于稳定，其中牛的IVP产量最大且成功率最高[14],[17],[19]。相比之下，马匹的IVP技术相对不成功，相关研究较少，且很少有IVP幼驹出生的报道[12],[33]。马匹胚胎生产面临诸多商业化挑战，这些挑战在其他物种中已得到缓解，但在马匹中由于物种差异和获取卵子的困难（马通常是单卵泡动物，对卵巢超刺激反应敏感，且作为非传统家畜需要特殊管理）而更加复杂[39]。历史上，需要辅助生殖技术的马匹（无论是通过冷却精液还是解冻精子）主要采用ICSI或卵子移植，这两种方法都需要通过侧腹剖腹手术进行转移，因为马胚胎在初期分裂阶段后的培养不可靠，因此无法采用非手术转移技术。尽管最近在培养条件方面取得了进展，但尚未明确导致马IVF失败的原因[23]。尽管多种因素阻碍了技术进步，但缺乏适当的条件和方案来诱导公马精子的功能成熟被认为是成功实施马IVF的主要障碍[2],[10],[30]。功能成熟是精子通过雌性生殖道过程中的最终成熟阶段，对于自然受精至关重要[42]。与其他哺乳动物的精子不同，公马精子在体外成熟条件下往往无法完成超激活、膜流动性增加和顶体反应等关键过程[24]。这些重要的生化和结构变化使精子能够结合透明带并穿透卵子[41]。因此，能够促进公马精子功能成熟同时保持顶体完整性的条件对于提高马IVF的成功率至关重要。
本文的目的是确定并优化适合体外受精的公马精子功能成熟条件。研究内容包括精子分离方法、保存条件以及冷却精子对功能成熟的影响，最终目标是保持精子的运动能力和顶体完整性，并通过酪氨酸残基的磷酸化来验证功能成熟。首先利用牛卵子与公马精子的结合来评估本文优化条件下的精子功能成熟状态。随后将解冻后的公马精子应用于改进的马IVF系统中，以评估其胚胎发育潜力。实验结果表明，新鲜公马精子在38°C下长时间孵育并非必需，且可能对运动能力产生不利影响。数据表明，在室温下保存精子足以实现功能成熟，并适用于之前冷却和解冻后的公马精子进行IVF。
实验设计
新鲜和冷却后的公马精子来自佛罗里达大学马教学单元的具有验证生育能力的商业夸特马（Quarter Horse）公马（共2匹），这些公马每天至少接受14小时的日光照射。5匹公马的冷冻精子由Select Breeders Services（切萨皮克市，马里兰州）提供，包括以下品种：荷兰温血马（2匹）、标准纯种马（1匹）、荷斯坦马（1匹）和威斯特法伦马（1匹）。马卵子来源
在38°C下孵育精子会随时间损害其运动能力和功能成熟度
初始实验使用了两匹不同公马的新鲜精子，以评估在38°C下保存精子对运动能力和功能成熟度的影响（共4次重复实验，每匹公马2次）。精液被分离后，通过Swim-Up或Percoll方法处理，并保存最多22小时，以确定功能评估参数的差异是否由分离方法引起。结果未发现时间点（0、4、8、12和22小时）与精子分离方法之间存在交互作用（Percoll
讨论
与牛和人类不同，公马精子似乎需要独特的条件才能诱导出类似功能成熟的变化和顶体反应[23]。此外，公马精子对其他物种中使用的成熟剂反应较弱[24]。这些成熟剂在触发顶体反应、改变膜通透性、超激活和酪氨酸磷酸化方面效果有限
结论
在室温条件下，新鲜和之前冷却过的公马精子可以实现功能成熟，同时保持运动能力并促进酪氨酸磷酸化，同时保持顶体完整性。与新鲜和冷却后的精子不同，冷冻保存的公马精子在分离后立即达到最大功能成熟度和运动能力。在室温下保存4小时的精子分离和保存程序
资助
JG获得了美国农业部（USDA）的国家需求奖学金（NIFA Grant 2021–38420–34067）的支持。
作者贡献声明
JDAL负责数据收集、分析和论文撰写。JEG、LK和MM在数据收集、实验设计和图形表示方面做出了重要贡献。VB提供了智力支持、实验设计和论文编辑。JWC负责精液收集和公马相关事宜。JHFP、PF和MM提供了智力支持。CT提供了卵子和运输安排。BD负责实验设计、理论分析和数据收集
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢In Vitro Equinos在智力和资金上的支持，以及Lazy E Ranch提供的卵子捐赠。同时感谢VetMotl提供的微流控设备。作者还感谢切萨皮克市Select Breeders公司的Paul Loomis博士和David Scofield博士捐赠的解冻公马精子。
