《Journal of Trauma and Acute Care Surgery》：Microvesicles in stored human whole blood increase thrombin generation via phosphatidylserine
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本研究揭示了储存全血在出现凝血潜力下降的同时，其内微囊泡（MV）浓度增加，并通过暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）增强了凝血酶生成潜力。这提示储存全血的促凝特性具有两面性，或可影响创伤复苏策略。
文章内容归纳
引言
失血性休克是创伤患者潜在可预防死亡的主要原因。近年来，平衡复苏及全血输注在创伤救治中的应用日益增多。随着全血在民用创伤领域的普及和血库“先进先出”库存管理，了解储存对全血止血特性的影响变得至关重要。
全血会发生与浓缩红细胞类似的储存损伤，导致细胞成分衰老并释放微囊泡。微囊泡是从细胞膜脱落的亚微米囊泡，来自储存浓缩红细胞的微囊泡已被证明可导致促凝状态、激活内皮细胞、启动中性粒细胞并在输注后促进肺部微血栓形成。
然而，体外粘弹性检测（如旋转血栓弹力测定法[ROTEM]）却提示储存全血表现出凝血潜力随储存时间延长而下降的储存性凝血病。我们旨在表征储存对人全血止血潜力的影响，并探究微囊泡在其中扮演的角色。
磷脂酰丝氨酸是一种通常位于细胞质膜内叶的磷脂。在细胞应激反应下，它可通过钙依赖性翻转酶暴露于外膜。磷脂酰丝氨酸还能为凝血酶原复合物提供支架，大大加速凝血酶原向凝血酶的转化。我们假设储存过程中产生的微囊泡在其外叶表达磷脂酰丝氨酸，从而导致凝血酶生成增加。
材料与方法
本研究获得了机构审查委员会的批准。通过含抗凝剂枸橼酸磷酸盐葡萄糖的采血针，从14名健康捐献者（6男8女，年龄20至30岁）采集全血，并在4°C下储存21天。
使用旋转血栓弹力测定法评估凝血功能，包括NATEM（全血加钙以评估自然凝血能力）和EXTEM（全血加钙和组织因子[TF]以评估外源性途径）。
通过校准自动血栓图（CAT）测定凝血酶生成。将分离自新鲜和储存全血样本的血小板贫乏血浆（PPP）加入含有PPP试剂（含TF和磷脂）或富血小板血浆试剂（仅含TF）的孔中。使用氟底物测量荧光强度，并由软件计算凝血酶生成参数。
通过连续离心从全血中沉淀微囊泡。微囊泡重悬后用针对红细胞（CD235a）、白细胞（CD45）或血小板（CD61）来源标记的抗体染色，在流式细胞仪上进行分析。尺寸门控使用0.1至1 μm微珠确定，并通过添加Triton-X扣除非囊泡事件。
为分析微囊泡对凝血酶生成的贡献，将储存21天的全血中分离出的微囊泡“单位”添加到新鲜冰冻血浆中。使用牛乳粘蛋白（Lactadherin）孵育10分钟以抑制磷脂酰丝氨酸的活性，然后将混合物加入PPP中评估凝血酶生成。
数据用Prism软件进行统计分析。使用适当的参数或非参数检验比较不同储存时间点的凝血功能及微囊泡浓度变化。
结果
全血储存后的凝血潜力
为评估储存期间全血的凝血潜力，将全血样本储存长达21天，并以7天为间隔使用ROTEM分析。NATEM检测显示，不同时间点之间的凝血时间、血块形成时间、α角和最大血块硬度均无差异（）。然而，当使用EXTEM分析（用TF刺激全血）时，凝血潜力随储存时间延长而下降，表现为凝血时间和血块形成时间增加，α角和最大血块硬度减小（）。这表明储存会在特定条件下（特别是由接触TF刺激凝血时）影响全血的凝血潜力。
全血储存时间延长使凝血酶生成增加
凝血酶生成是凝血级联反应的最终结果，反映了血浆的功能性凝血潜力。在储存期间，通过CAT分析测量了凝血酶生成。当用TF和磷脂刺激从储存全血分离的PPP时，发现凝血酶生成、内源性凝血酶潜能、峰值凝血酶和速率指数随储存时间延长而增加（）。当仅用TF刺激PPP（不添加外源性磷脂）时，也观察到凝血酶生成、内源性凝血酶潜能、峰值凝血酶和速率指数的增加（）。这些数据共同表明，全血储存时间越长，凝血酶生成越强。
全血储存期间微囊泡浓度增加
为了评估储存对微囊泡浓度的影响，从全血中分离微囊泡，并用细胞来源标记物染色。储存21天后，与储存第1天相比，红细胞来源和血小板来源的微囊泡均有所增加（）。血小板来源微囊泡的增加主要归因于表达磷脂酰丝氨酸的微囊泡，而红细胞微囊泡的增加则主要是不表达磷脂酰丝氨酸的微囊泡。
微囊泡通过内源性磷脂增加凝血酶生成
为了确定微囊泡在凝血酶生成增加中的作用，将来自储存21天全血的微囊泡添加到分离自储存0天或21天全血的PPP中。当用TF和磷脂刺激时，在储存第21天（而非第0天），微囊泡的添加导致内源性凝血酶潜能和峰值凝血酶增加。
当用仅含TF（不含外源性磷脂）的试剂刺激经微囊泡处理的PPP时，与空白对照相比，凝血酶生成发生了改变（）。在储存第0天和第21天，添加微囊泡并用TF单独刺激，均导致内源性凝血酶潜能、峰值凝血酶和速率指数增加。
随后，我们使用牛乳粘蛋白阻断微囊泡上的内源性磷脂酰丝氨酸，然后评估其对凝血酶生成的影响。这种处理显著抑制了微囊泡对凝血酶生成的影响（）。这些数据共同表明，储存全血中存在的微囊泡驱动了凝血酶生成，且该过程可被乳粘蛋白抑制。
讨论
本研究评估了储存对人全血凝血潜力的影响。数据显示，全血在储存后于EXTEM粘弹性检测中表现出凝血潜力下降；然而，单独评估凝血酶生成时，却发现其随储存时间延长而增加。进一步的实验表明，凝血酶生成的增加归因于储存期间全血中积累的微囊泡上所携带的内源性磷脂。
粘弹性测试（特别是反映TF刺激凝血的EXTEM检测）显示凝血潜力随储存而减弱，这与先前关于储存性凝血病的研究一致。这些变化可能反映了储存期间血小板功能下降、纤维蛋白原可用性降低以及累积的代谢紊乱。但在本研究中，NATEM参数在整个储存期间保持稳定，提示内在的凝血酶生成机制保持完好，并可能弥补其他凝血缺陷。这种补偿作用在EXTEM检测中可能不明显，可能是因为TF刺激压倒了微囊泡的任何效应。
数据显示，当用TF和磷脂刺激PPP时，凝血酶生成随时间增加。当去除外源性磷脂后，凝血酶生成仍增加，提示PPP中存在内源性磷脂来源。我们证明，添加微囊泡后，无论是否存在外源性磷脂，凝血酶生成均增加。通过使用乳粘蛋白阻断磷脂酰丝氨酸，将这一效应归因于暴露在微囊泡外膜上的磷脂酰丝氨酸。在不添加外源性磷脂的情况下，用乳粘蛋白处理微囊泡后，将其加入PPP仅产生极少的凝血酶生成。这表明磷脂酰丝氨酸在微囊泡的促凝特性中起着重要作用。
数据还表明，储存人血中大部分磷脂酰丝氨酸阳性的微囊泡来源于血小板。尽管红细胞微囊泡可能在老年血的促血栓状态中发挥自身作用，但血小板微囊泡及其高浓度的磷脂酰丝氨酸很可能是导致储存时间越长、凝血酶生成越多的刺激因素。基于小鼠血液储存模型的研究表明，用乳粘蛋白阻断磷脂酰丝氨酸后添加微囊泡仍会产生一些凝血酶生成，提示微囊泡上的TF活性也促成了凝血酶生成。这些数据来自小鼠血液储存模型，而已知该模型比人全血产生更多的红细胞微囊泡。在本研究中，磷脂酰丝氨酸抑制在不添加外源性磷脂的情况下显著降低了凝血酶生成。这再加上数据显示人全血储存中产生的大部分微囊泡来源于血小板，表明这一发现主要由表达磷脂酰丝氨酸的血小板来源微囊泡驱动，而非红细胞微囊泡上的TF活性。
基于数据，全血在ROTEM上表现出凝血强度下降，但在CAT上表现出凝血酶生成增加。这体现了全血体外凝血检测的复杂性。我们推测，ROTEM可能展示了降解对外源性通路中细胞成分的影响，而CAT则更全局地展现了PPP中的止血情况，从而凸显了微囊泡的作用。数据表明，储存全血的凝血特征仍需研究，但全血中积累的微囊泡在权衡血栓风险后，可能为出血性创伤患者提供更多的凝血益处。
本研究的一个局限是储存过程中脱落的微囊泡群体具有异质性。虽然能够量化每种细胞来源的微囊泡浓度，但无法直接将微囊泡对凝血的影响与特定细胞类型直接配对。尽管血小板微囊泡占磷脂酰丝氨酸阳性微囊泡的百分比最高，但无法量化每种微囊泡暴露了多少磷脂酰丝氨酸。此外，研究使用了来自男性和女性捐献者的全血。先前研究表明凝血功能存在性别二态性，女性全血与更强的凝血性相关。我们选择从男女志愿者处采集血液，以更好地代表献血人群。需要进一步研究以阐明与血液储存相关的凝血性别二态性。另一个局限可能与本研究评估的捐献者样本量相对较小有关。
研究结果对全血储存具有重要意义。虽然ROTEM检测到凝血潜力随储存下降，但储存全血会积累促凝微囊泡，特别是富含磷脂酰丝氨酸的血小板来源囊泡，这些囊泡增强了凝血酶生成。此外，全血储存过程中产生的微囊泡可能显著影响创伤和失血性休克的复苏策略。在急性创伤性凝血病的背景下，这些促凝微囊泡可能有助于恢复止血和改善早期血流动力学稳定性。然而，随着患者向高凝状态转变，这可能增加血栓并发症的风险。需要进一步研究以明确创伤后微囊泡暴露的时间和临床影响。
