《Biophysical Reviews》：Through the holes: the biotechnological potential of actinoporins (and other PFPs)
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本文系统评述了孔道形成蛋白，尤其聚焦于海葵actinoporins，探讨了其从天然毒素到生物技术工具（如生物传感、纳米孔测序、蛋白质组学分析）的转化潜力，并展望了基于PFPs设计新型人工纳米反应器（如用于塑料降解）的广阔前景，为未来相关生物纳米技术发展提供了重要见解。
在生命科学的微观战场上，有一类独特的蛋白质士兵，它们被称为孔道形成蛋白。这些蛋白由单一多肽链构成，普遍存在于从细菌到人类的各类生物体中，是生物体攻防战中的利器。它们最特别之处在于能够打破我们对蛋白质分类的固有认知——这些蛋白质并非传统意义上的水溶性蛋白或膜蛋白，而是能够在水相中以稳定的单体形式存在，一旦找到合适的脂质膜靶标，便能通过神奇的“变形记”，嵌入膜中并聚合成孔，从而改变细胞膜的通透性。这篇综述将带领我们深入探索这个迷人蛋白质家族的生物技术潜能，尤其聚焦于来自海葵的actinoporins。
孔道形成蛋白
Pore-forming proteins是一个庞大、普遍且迷人的蛋白质家族。它们作为稳定的水溶性单体被合成，但拥有结合特定脂质膜的能力。与膜结合后，局部蛋白质浓度增加，扩散被限制在二维系统，从而促进了导致成孔的寡聚化过程。在此过程中，它们经历构象转变，最终成为整合膜蛋白。PFPs攻击细胞的边界——质膜，因此大多数PFPs是毒素，参与多种攻击或防御机制。它们可以根据最终孔道构象中的折叠方式进行分类：如果孔壁由α-螺旋定义，则为α-PFPs；如果孔壁由β-链定义，则为β-PFPs。例如，金黄色葡萄球菌α-溶血素是β-PFPs的代表，而来自向日葵海葵的sticholysin II则是α-PFPs的例子。孔的大小和通透性选择性因不同的PFP而异，允许的物质范围从小离子到中等大小的蛋白质。因此，受攻击的细胞通常会死于渗透压休克。
Actinoporins
在PFPs的大家族中，来自海葵的actinoporins脱颖而出。它们是小型的、不含半胱氨酸的蛋白质，由不同的海葵分泌。它们通常显示碱性等电点并形成阳离子选择性孔。actinoporins产生漏斗状孔，在其较窄的trans侧直径约为1-2纳米。与许多其他毒素一样，actinoporins构成多基因家族，同一个体可以产生不同的actinoporins亚型。尽管已描述了大量的actinoporins天然变体，但仅有五种的水溶性单体结构在原子细节上得到解析：来自加勒比海葵Stichodactyla helianthus的sticholysins I和II，来自大西洋海葵Actinia fragacea的fragaceatoxins C和E，以及来自欧洲和地中海沿岸常见海葵Actinia equina的equinatoxin II。这五种蛋白质的单体水溶性结构均由一个β-夹心结构组成，两侧各有一个α-螺旋，两个α-螺旋位于两个β-片层外表面的凹陷处。
actinoporins通过识别鞘磷脂特异性结合其靶膜，SM常被视为其受体。SM的存在是结合的基本要求，但膜的其他几种物理化学特性可以极大地影响或调节actinoporins的功能，其中膜中胆固醇的存在和影响可能是最显著的特征之一。导致阳离子选择性孔的actinoporins寡聚化似乎优先发生在原体与膜结合之后。最终热力学稳定孔复合物的步骤和化学计量似乎已最终解决，但其潜在的分子机制仍有待完全阐明。最近的研究揭示了新的见解，检测到对应于成孔中间体的弧形组装体，从而提出了迄今为止最详细的机制。α-螺旋1的延伸作为成孔的初始步骤已被描述，并被认为是该过程的关键步骤。单体似乎一个接一个地结合到膜上的初始单体，导致弧随着螺旋延伸过程而生长，直到弧最终闭合形成一个完整的孔。
Actinoporins as lipid biosensors
actinoporins对SM的识别具有高度特异性。利用这一特性，其中一些已被改造用作不同细胞和亚细胞位置的SM生物传感器。例如，荧光标记的EqtII突变体被用来检测细胞膜上所谓的抗去垢剂结构域。非毒性修饰版本的EqtII进一步将这一模型精化并扩展到质膜的胞质小叶，显示了SM在多种细胞质膜胞质小叶中的存在。它还表明，SM在胞质小叶中与胆固醇等典型的脂筏脂质形成小的、瞬时的簇，为未来的信号转导研究提供了新的框架。
Biotechnological uses of nanopores
纳米孔正成为无数设备生物技术设计的基础。PFPs与合成生物学和蛋白质工程的最新进展相结合，在药物递送、基于细胞的疗法以及生物传感等领域开辟了新的可能性。事实上，PFPs也是旨在优化DNA作为计算存储材料使用的尖端技术的核心。这种技术正在快速发展，目前已有基于膜纳米孔的低成本便携式设备上市。这些设备已被文献描述用于核酸的单分子测序、肽鉴定和蛋白质测序，或蛋白质糖基化的鉴别。除基于PFP的系统外，基于DNA的设备也正在开发以构建纳米孔分子工具。
金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白纳米孔是典范。α-HL已被深入研究作为一种廉价、快速的纳米孔来执行所有这些生物技术任务。它有用于单分子水平共价化学、核酸分析和测序或蛋白质组学分析的例子。α-HL产生一个β-PFP蘑菇状孔，其直径1.4纳米的收缩将孔内部分为前庭和桶状区室。当通过其孔进行ssDNA的顺式到反式电泳易位时，会发生离子电流的阻断。这些阻断的大小和易位时间对于不同组成的多核苷酸是不同的。这导致了快速、廉价的ssDNA测序方法的开发，当DNA通过孔时，可以逐个识别ssDNA中特定位置的碱基。然而，这只有在DNA被固定在孔内时才可能。游离的ssDNA易位太快，碱基鉴别无效。因此，已经开发了几种方法来降低DNA穿过这些孔的速度。分子内碱基配对导致的二级结构也可能干扰测序过程，幸运的是，通过使用高浓度变性剂可以避免这些相互作用，因为即使在7M尿素中，孔也能保持功能。
最初广泛应用于核酸单分子检测的纳米孔传感，现在也正在扩展到蛋白质传感。然而，这些设备的一个主要限制是蛋白质在纳米孔表面的非特异性吸附，这可能导致孔堵塞。这个问题可以通过使用多种设计或在孔中引入蛋白质或核酸适配体来解决。
在过去的二十年里，已经发表了许多例子，这些有毒蛋白质被改造用于执行单分子任务，如生物传感、蛋白质和核酸测序、鉴别蛋白质化学修饰、蛋白质组学分析，甚至在计算方法中使用DNA。最近，PFPs也被用作设计新型人工纳米反应器以催化不同化学反应的模板。其中一个有前景的方案是最近发表的概念验证，表明actinoporins可以转化为生物可持续的塑料降解纳米反应器。优化和开发具有更高活性和新特异性的未来基于PFP的纳米反应器，以降解由不同化学成分制成的污染塑料废料，似乎是一个值得探索的途径。
