引言：农业生态系统中的脊椎动物捕食者
近年来，将农业与野生动物保护相结合的努力重新激发了人们对脊椎动物如何通过生物防治（biocontrol）有益于作物生产的兴趣。一些鸟类和哺乳动物显示出调节害虫种群的潜力，但其他捕食者也可能因其频繁捕食其他天敌而干扰生物防治。虽然恒温动物是当前研究的重点，但包括无尾目（蛙类和蟾蜍）在内的食虫性变温动物在农业景观中也很常见。然而，关于无尾目动物如何影响害虫管理的知识却出人意料地稀少。现有科学文献主要集中在海蟾蜍（Rhinella marina）上，这是一个经典的生物防治失败案例。相比之下，在亚洲稻田生态系统中，原生无尾目动物被确定为飞虱等植食性害虫的重要捕食者，显示出作为生物防治剂的潜力。但在世界大部分地区，对其生物防治潜力的研究仍然很少。
在北美，早期对蟾蜍（Anaxyrus sp.）的研究基于其胃内容物中存在鳞翅目幼虫，以及它们在害虫爆发期间的大量捕食，认为其有助于抑制害虫种群。然而，后来的研究发现蟾蜍的食谱主要以杂食性和捕食性的蚂蚁和甲虫（步甲科、隐翅虫科）为主，导致至少一位研究人员认为蟾蜍的生物防治价值值得怀疑。预测蟾蜍对作物植物的影响是具有挑战性的，因为它们作为广谱性捕食者，会消耗属于不同营养类群的多种猎物，包括其他捕食者，这种行为被称为“集团内捕食”（intraguild predation, IGP）。理论表明，当顶级捕食者消耗与其中间捕食者共同捕食的猎物时，可能会破坏生物防治，除非顶级捕食者在抑制害虫为害方面比中间捕食者更高效。然而，捕食者不仅可以通过消费来影响猎物，还可以通过影响它们的行为和生理产生“非消费效应”（non-consumptive effects），这些效应与消费效应的规模相似，并可能构成对植物级联效应的主要部分。
本研究以美洲蟾蜍（Anaxyrus americanus）为对象，探究了其在蔬菜农业生态系统中对生物防治的贡献潜力。这种夜间活动的食虫物种原生并广泛分布于北美东部。春季在淡水池塘（包括灌溉池塘）繁殖后，蟾蜍会扩散到包括郊区后院和作物田在内的各种栖息地。农业覆盖和农场池塘似乎能促进其丰度和繁殖成功。从理论上讲，该物种对作物的影响范围可能从正面到中性再到负面，这取决于其捕食的平衡及其间接效应的总和。为了阐明这些营养动态，本研究（1）通过在蔬菜农场进行胃内容物分析确认了该物种的饮食，并将饮食组成与田间可得性进行比较；（2）进行实验室实验，以识别与猎物特征相关的捕食行为驱动因素；（3）进行初步的围栏实验，通过操控蟾蜍密度来测量其对无脊椎动物群落和羽衣甘蓝生产力的影响。这些调查共同揭示了美洲蟾蜍是否以及在何种条件下可能有助于蔬菜生产中的害虫管理。
材料与方法
本研究主要在宾夕法尼亚州中部的迪金森学院农场（Dickinson College Farm）进行。该农场主要为粉砂壤土，实行有机蔬菜种植和草饲肉类生产轮作。场地上有一个大型灌溉池塘，是美洲蟾蜍的繁殖地，以及几个旨在鼓励蟾蜍在产区附近定居的较小“枢纽池塘”。
蟾蜍胃内容物分析
为了分析蟾蜍的饮食，研究人员在其活动季节（2015年5月至8月）通过视觉相遇调查法收集蟾蜍。捕获后，测量其吻肛长度（snout-to-vent length, SVL）和质量，并通过雄性喉部的黑色斑块识别性别。为了避免重复采样同一只个体，通过皮下注射器在蟾蜍背部皮下植入被动式集成应答器（passive integrated transponder, PIT）标签对其进行唯一标记。随后，遵循Solé等人描述的方法获取胃样本，每次采集最多尝试三次。处理后，通常在5分钟内将蟾蜍在捕获点释放。为确保胃样本的独立性，同一只个体在前一次采样后10天内获取的样本被排除在分析之外，这是一个保守的选择，因为该物种大约在24小时内清空胃部。最终样本包括来自35只独特蟾蜍的37个胃样本。
胃样本中的无脊椎动物在解剖显微镜下使用二分法检索表进行鉴定，并尽可能归类到最低的分类单元。通过计算头、完整身体、成对结构等来估计猎物等效数。无脊椎动物分类单元根据文献和标准参考资料进一步归类到营养类群。数据在R统计语言中进行描述性汇总和分析，以确定蟾蜍是否按比例捕食各类群。研究人员计算了每个分类单元所占猎物等效数的平均比例，以及在产区采集的晚季胃样本（7-8月，n=15）中包含每个分类单元的蟾蜍胃比例。然后，将这些值与每个分类单元在田间活动密度的比例进行回归分析。田间活动密度是根据下方田间实验的对照区域中的陷阱捕获样本估计的。陷阱捕获量反映了地表丰度和活动性，是衡量猎物可得性的合适指标，因为该研究物种倾向于捕食活动性猎物。由于实验室研究表明蟾蜍存在一个低于4-5毫米的尺寸感知阈值，因此在排除微小无脊椎动物（长度≤3毫米：弹尾虫、螨虫、蚜虫、蓟马和寄生蜂）后，重复了这些分析。
实验室蟾蜍取食行为试验
为了阐明驱动蟾蜍捕食行为的机制，研究人员在实验室中向两个生命阶段的蟾蜍呈现了不同猎物分类。在2022年6月和7月收集了幼体和成体蟾蜍，并在气候受控的实验室中饲养。在每次试验前，停止喂食24-96小时以确保其捕食动机。实验采用完全交叉设计，其中幼体和成体蟾蜍被呈现22种潜在的无脊椎动物猎物分类单元。无脊椎动物主要在研究地点采集，少数来自附近的菜园。这些分类单元代表了一系列分类群、营养类群、大小和行为。试验中记录了三种不同的蟾蜍行为：（1）定向：头部朝向并固定于猎物；（2）接近：蟾蜍向猎物移动；（3）捕食：舌头向猎物伸出。无脊椎动物猎物在每次试验中的活动被半定量地评分为5个等级。如果难以评分，则通过回看录像做出最终判定。
为了识别哪些变量最能预测蟾蜍的觅食行为，研究人员进行了“随机森林”分析。预测变量包括蟾蜍特征（生命阶段、质量、吻肛长度、个体ID）和猎物特征（分类群、营养类群、大小、数量、活动性以及是否在瓶中呈现），而模型预测的响应是行为发生的概率。研究人员使用75%的观测值训练模型，剩余的25%用于测试其性能。通过变量重要性和偏相关图来评估结果。
操作实验：羽衣甘蓝围栏中的蟾蜍
为了研究美洲蟾蜍对无脊椎动物群落和作物生产力的净影响，研究人员在2019年夏季和秋季在羽衣甘蓝围栏中进行了初步操作实验。实验采用随机完全区组设计，设三个区组和三种处理，即0、1或2只幼体蟾蜍/平方米（每个围栏0、3或6只蟾蜍；每个处理n=3个围栏）。这些密度代表了农业栖息地中蟾蜍密度的范围，最高可达围栏的承载能力。尽管样本量有限，但仍呈现了这些结果，因为它们为其他实验提供了重要的功能性见解，并可能激发未来的研究。
在初夏研究开始前，农场工作人员在一个田块中耕作并准备了一个垄。羽衣甘蓝幼苗在2019年7月3日处于三叶期时移栽，株行距符合当地秋季生产实践。作物定植后的7月初，用镀锌钢板建造了九个金属围栏。每个围栏为1.5 × 2米，沉入地下约20厘米以防止蟾蜍挖洞逃逸。一半围栏覆盖作物行，另一半包含边缘草地，因此模拟了田间边缘的生境。每个围栏包含一个覆盖板和饮水碗以促进蟾蜍生存，以及一个与地表齐平的陷阱。通过人工浇水、除草和修剪草来维护围栏，并标准化了所有围栏的维护。为了评估与围栏相关的潜在干扰，研究人员在作物行的更远处划定了三个与围栏大小相似的区域作为无围栏对照。
幼体蟾蜍在7月下旬的几个晚上在研究地点收集。在引入围栏前，进行了PIT标记、测量和称重。蟾蜍被随机分配到围栏中，于2019年8月13日释放以达到目标密度。
为了量化作物生长，每周测量从土壤表面到顶生分生组织的每株植物高度。无脊椎动物采样旨在（1）量化羽衣甘蓝最重要害虫的活动，以及（2）描述地表无脊椎动物群落特征，这是蟾蜍最有可能觅食的地方。由于毛毛虫是该地区芸薹属作物最重要的害虫之一，每周搜索植物并记录每株植物的毛毛虫数量。在研究中期，从每株植物随机选取三片叶子拍照，随后使用ImageJ软件分析，以量化被植食者取食的叶面积百分比。最后，为了评估蟾蜍对无脊椎动物群落的累积影响，在研究结束时按以下描述收集陷阱样本。
研究于2019年9月25日结束。搜索围栏以找回蟾蜍，通过PIT标签识别，并测量和称重。为了评估蟾蜍对无脊椎动物群落的累积影响，于2019年9月26日打开陷阱并注入2.5厘米肥皂水。陷阱保持开放6天，之后收集样本，过滤并转移到75%乙醇中。节肢动物使用分类学参考资料进行鉴定，并分配到营养类群。为了测定作物生物量，于2019年9月27日在田间收获每株植物的地上部分，然后在65°C下干燥4天并称重。选择测量累积生物量而非模拟商业采收，这符合本研究阐明营养关系的重点，但承认这限制了解释结果相对于商业化生产的能力。
为了分析数据，研究人员采用广义线性模型方法，模型形式为：响应变量 ~ 处理 + 区组，使用适合每个响应变量分布的误差结构和连接函数。当处理产生显著效应时，使用“emmeans”包进行所有蟾蜍密度处理之间的成对比较，并采用Tukey's honest significant difference检验。当p < 0.05时认为效应显著，p < 0.10时认为边缘显著。
结果
蟾蜍胃内容物分析
胃样本涵盖整个季节，包括成体和幼体，并采集自不同生境，包括产区、温室、池塘附近以及道路或建筑物周围。蟾蜍在季节早期更常见于灌溉池塘或道路附近，而在季节晚期则更多出现在产区。猎物完整性各异，96%可识别，94%可鉴定到足以分配营养类群。
胃样本中位数包含2.5个猎物等效物，属于2个分类群。胃样本中最丰富的分类单元是隐翅虫、蚂蚁、步行甲和蜘蛛，它们共同占所有被捕食猎物的80%以上。这些类群也是最常被捕食的，每个都出现在超过15%的样本中。蚂蚁是单一最常被捕食的类群，出现在46%的样本中。由于在田地和温室采集的样本与生物防治最相关，研究人员也专门总结了这些样本的结果。猎物消耗的模式与全样本非常相似，隐翅虫、蚂蚁、步行甲和蜘蛛构成了最丰富和最常被捕食的猎物。
无脊椎动物在田间环境中的活动密度与蟾蜍胃样本中猎物的平均丰度呈正相关。这种关系的强度较弱，但当排除可能因尺寸过小而不被蟾蜍感知为猎物的微小分类单元时，关系变得更强。隐翅虫是一个明显的异常值，其被捕食的比例高于基于其活动密度的预期。研究人员还测试了田间可得性是否与捕食频率（以含有至少一个猎物的蟾蜍胃比例表示）相关。结果发现了一个显著但中等强度的关系，排除微小猎物后关系强度进一步增强。
实验室蟾蜍取食行为试验
在实验条件下，蟾蜍对猎物表现出强烈的反应倾向：在所有试验中，它们分别有82%和75%的情况会定向和接近猎物。捕食行为发生在半数试验中，范围从粉虱的0%到蟋蟀的近80%。有趣的是，在实验室试验中，蟾蜍对所有植食性猎物的捕食频率都高于蚂蚁和隐翅虫，而这两种是田间最常被蟾蜍消耗的类群。
随机森林分析生成的模型表现良好，在预测蟾蜍的定向、接近和捕食行为方面，准确率分别为81%、84%和83%。在所有三种蟾蜍行为中，猎物的营养类群是最不重要的变量之一，而猎物大小和活动性是迄今为止最重要的。无论蟾蜍处于哪个生命阶段，似乎都存在一个猎物大小阈值（约4-5毫米），低于此阈值，猎物引发捕食行为的可能性较小，而高于此阈值，行为发生的可能性相似。蟾蜍对活动的反应更为连续，捕食行为的可能性通常随着活动水平的增加而增加。
操作实验：羽衣甘蓝围栏中的蟾蜍
蟾蜍结果
研究结束时，除一个围栏外，所有围栏都包含指定数量的蟾蜍。一个六蟾蜍围栏在回收时仅剩一只蟾蜍，很可能与一只白足鼠挖穿围栏屏障形成的隧道有关。由于不清楚该围栏中的蟾蜍何时逃逸，研究人员按计划进行了分析。检查观测值分布后，未发现受损围栏对结果产生不当影响的证据。
蟾蜍质量变化是在个体基础上计算的，然后在每个围栏内取平均值进行分析。蟾蜍在研究期间体重增加，并且没有食物限制的证据，因为两种蟾蜍密度下的质量增加相似。
与无脊椎动物相关的结果
羽衣甘蓝上观察到的最重要害虫是跳甲和食叶毛毛虫，其主要种类是菜粉蝶幼虫和十字纹菜蛾幼虫。叶面损害似乎主要由毛毛虫造成，其特点是大型、不规则的孔洞和边缘取食，而非跳甲典型的弹孔状损害。毛毛虫的季节性丰度或叶面损害在处理之间没有显著差异。
研究结束时的陷阱样本显示，蟾蜍影响了几种无脊椎动物分类单元的活动密度。蚂蚁和步行甲都表现出阶梯式反应，在零蟾蜍对照中密度最高，在高蟾蜍处理中密度最低。甲螨在最中等的蟾蜍处理中最为丰富，在零蟾蜍对照中最不丰富。植食性、捕食性和寄生性分类单元对蟾蜍密度没有显示出显著反应。虽然未对围栏效应进行正式测试，但在同一田地围栏旁测量的活动密度表明，围栏可能影响了一些分类单元的活动密度。值得注意的是，步行甲、蜘蛛和隐翅虫在围栏外的活动密度分别是零蟾蜍对照内的大约两倍、三倍和十倍。
与植物相关的结果
羽衣甘蓝的生长速率在不同蟾蜍密度处理之间没有显著差异。同样，研究结束时的生物量（与作物产量最密切相关的响应）也未因蟾蜍密度处理而显著变化。
讨论
本研究从多个角度探讨了美洲蟾蜍的生物防治潜力，得出结论：该物种对害虫管理的贡献很可能是高度情境依赖性的，取决于特定种植系统中关键无脊椎动物类群的特征和行为，以及作物物候和结构。这一结论基于整合了（1）田间采集蟾蜍的胃内容物分析、（2）蟾蜍行为驱动因素的行为实验，以及（3）在羽衣甘蓝农业生态系统中的初步围栏研究的结果。
在宾夕法尼亚州的一个蔬菜农场，美洲蟾蜍频繁捕食隐翅虫、蚂蚁、步行甲和蜘蛛，这与之前对该物种及其相关蟾蜍物种的胃内容物研究结果一致。本研究的方法可能低估了软体猎物（如蛞蝓和蚯蚓）的占比，因为它们消化率不同。这种可能性值得进一步研究，因为这些类群在实验室实验中引发了蟾蜍的捕食行为。尽管如此，蛞蝓和蚯蚓确实会留下消化残留物。未来对胃内容物的研究可以结合微观方法和通过遗传物质检测来补充。
蟾蜍对无脊椎动物类群的消耗与它们的田间活动密度呈中等程度的正相关，这在一定程度上支持了猎物可得性驱动蟾蜍捕食模式的假说。然而，这种发现对生物防治的意义并非一目了然。猎物可得性并不能完全解释蟾蜍的捕食模式。隐翅虫在蟾蜍食谱中的比例过高，这种模式可能反映了采样偏差而非蟾蜍行为。另一方面，几种小型碎食性类群在陷阱捕获中相对丰富，但在蟾蜍胃样本中完全不存在，这部分原因被我们对蟾蜍觅食行为的发现所阐明。
在实验室中，美洲蟾蜍对猎物大小和活动性的捕食行为反应，而非营养类群，这与视觉线索在释放蟾蜍取食行为中的首要地位是一致的。猎物类群的活动性和显著性无疑受到实验室人工条件的影响，但蚂蚁、隐翅虫、步行甲和蜘蛛在胃样本中的频繁出现与它们在田间的活动模式是一致的。这些类群通常在夜间活跃于地表，而这正是蟾蜍倾向于觅食的时间和地点。猎物大小（约4毫米）的下限有助于解释弹尾虫、甲螨和寄生蜂在蟾蜍食谱中代表性不足的原因，它们可能太小而无法引发实验室蟾蜍（SVL > 41毫米）和大多数田间采集蟾蜍（平均SVL为60±22毫米）的取食行为。然而，较小的个体可能会捕食这些小型猎物，正如其他研究中所发现的那样。蟾蜍会攻击超过最低尺寸阈值的多种猎物，这支持了它们的消耗模式是灵活且情境依赖的假设。
尽管频繁的集团内捕食减少了围栏中蚂蚁和步行甲的活动密度，但在有蟾蜍存在的地方，羽衣甘蓝植物并未经历植食性为害增加或生产力下降，这对我们关于集团内捕食会破坏生物防治的假设提出了挑战。这一发现最可能的解释是，在该系统中，步行甲和蚂蚁并未显著捕食叶栖毛毛虫（本实验中的主要害虫）。事实上，先前的研究已确定鸟类、瓢虫和叶栖蜘蛛是芸薹属叶片上毛毛虫最重要的捕食者。步行甲和蚂蚁确实通过捕食该害虫的土栖生命阶段，有助于蔬菜中跳甲的生物防治。然而，跳甲为害通常在芸薹属植物移栽后不久对幼苗最为严重，而这个时期发生在我们将蟾蜍引入围栏之前。
虽然蟾蜍对蚂蚁和步行甲的负面影响在本实验中并未级联到羽衣甘蓝植物，但在其他种植系统中可能会产生影响。值得注意的是，这些多样化的杂食性类群本身对作物就有不同的影响。许多蚂蚁物种是农业害虫的重要捕食者，但有些也保护和促进吸汁性植食者的种群。然而，在该研究系统中未观察到这种现象。值得注意的是，许多蚂蚁和步行甲物种通过种子捕食帮助调节杂草种群。
最后，虽然本研究的围栏设计阐明了蟾蜍对羽衣甘蓝无脊椎动物群落的影响，但它持续时间有限，并引入了限制我们解读的干扰。围栏可能影响了某些无脊椎动物（包括步行甲、隐翅虫和蜘蛛）的密度。在开阔的田间环境中，这些猎物类群在蟾蜍消耗后或响应植食者密度的变化后，很可能会重新定殖一个区域，这可能会加强整体的自上而下的调节。此外，先前对美洲蟾蜍及其相关物种的研究表明，其食谱在整个季节会发生显著变化，春季对鳞翅目幼虫的捕食增加，对步行甲的捕食减少。在春季与夏季或秋季以及连续几年进行比较研究，以捕捉年际变异性，将具有重要价值。最后，我们在羽衣甘蓝中的发现可能不适用于具有不同物候或结构的作物。蟾蜍对植食性害虫的有限影响可能与其直立的株型结构有关，在这种结构中，叶片（许多植食者产卵和取食的地方）在生长季节越来越远离蟾蜍的影响范围。我们假设，蟾蜍更可能影响那些具有匍匐生长习性、作物冠层更接近地面，并且关键害虫在夜间穿越地表的作物。
总体而言，美洲蟾蜍在该蔬菜生产系统中似乎是中性的。尽管蟾蜍频繁进行集团内捕食，但我们并未观察到植物损害增加或羽衣甘蓝生产力降低。我们预测，当关键害虫属于中大型、频繁活动、夜间活动、活跃于地表和/或作物冠层能保持植食者在地面附近的蟾蜍影响范围内时，蟾蜍最有可能对生物防治做出贡献。鉴于蟾蜍频繁捕食蚂蚁，在蚂蚁促进重要吸汁性害虫的地方，蟾蜍可能是有益的。在更广泛的种植系统和季节中进行的研究将进一步阐明该物种在害虫管理中的潜力。
