《Microchemical Journal》：HS-GC-IMS authenticates the botanical origin of seven types of Italian monofloral honey, annotating the significant volatile compounds by the novel HS- SPME-GC-IMS-MS prototype
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单花蜜鉴定、HS-GC-IMS、机器学习、挥发性化合物分析、意大利
菲利波·帕尼（Filippo Panni）| 安德烈亚·马萨罗（Andrea Massaro）| 卢卡斯·博登本德（Lukas Bodenbender）| 卡梅拉·扎科梅蒂（Carmela Zacometti）| 罗伯托·皮罗（Roberto Piro）| 安杰拉·费利西塔·萨维诺（Angela Felicita Savino）| 菲利普·韦勒（Philipp Weller）| 亚历山德拉·塔塔（Alessandra Tata）
意大利农业、粮食主权和林业部，农业食品产品质量监管与欺诈打击中央监察局（ICQRF），佩鲁贾实验室，Via della Madonna Alta 138 c/d，佩鲁贾，PG，意大利
摘要
欧洲理事会通过了2024/1434号指令，以加强蜂蜜的市场标准并改进标签标识。为打击蜂蜜欺诈行为，理事会建议加强监管并采用创新方法来检测蜂蜜掺假和错误标注现象。为此，我们探讨了顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）的分析能力。具体来说，我们研究了HS-GC-IMS结合统计学方法是否能够有效验证意大利单花蜂蜜的来源。我们直接分析了2022年和2023年收获的136种意大利单花蜂蜜样本，这些蜂蜜来自七种不同的花卉来源（金合欢、蒲公英、栗子、杜鹃花、柑橘、向日葵和椴树）。这些样本之前已经通过感官分析和理化评估进行了鉴定。预处理后的数据经过主成分分析（PCA）以探索HS-GC-IMS的区分能力。随后，基于PLS-DA的机器学习分类器分别实现了93.10%、90.0%和98.75%的准确率、灵敏度和特异性。
最后，我们使用顶空固相微萃取气相色谱-离子迁移谱-质谱（HS-SPME-GC-IMS-MS）原型技术对每种单花蜂蜜中特征性挥发性化合物进行了鉴定。这是首次报道这种具有双重检测系统的新型原型技术，用于鉴定不同单花蜂蜜中的挥发性有机化合物。
这些结果证明了：i) 这种结合HS-GC-IMS与机器学习的协同方法在蜂蜜鉴定中的潜在效用；ii) HS-SPME-GC-IMS在准确鉴定蜂蜜挥发性化合物方面的开创性能力。
引言
单花蜂蜜因其主要由单一植物的花蜜制成而具有独特的风味。根据花卉来源的不同，单花蜂蜜具有特定的感官特性、理化性质和健康益处，这些因素使其商业价值高于混合蜂蜜。因此，单花蜂蜜比其他类型的蜂蜜更容易被错误标注。
由于许多从非欧盟国家进口的蜂蜜涉嫌掺假或地理来源标注不实（欧盟“来自蜂箱”协调行动2021–2022），欧洲议会和理事会于2024年5月14日通过了2024/1438号指令，对2001/110/EC指令进行了修订。该指令旨在加强蜂蜜的市场标准并改进标签标识。具体而言，欧洲理事会通过了2024/1434号指令，以加强蜂蜜的市场标准并改进标签标识。修订内容及相应的2024/1438号指令于2024年5月24日公布，旨在解决欧洲日益严重的蜂蜜真实性问题。在理事会辩论中，多位部长强调仅靠标签标识不足以防止海外生产商的不公平竞争，并敦促委员会开发分析方法来检测蜂蜜并打击欺诈行为。实际上，2024/1432号指令明确规定应建立欧盟蜂蜜参考实验室，通过标准化方法加强监管、检测蜂蜜掺假，并使用最新的创新测试方法系统地验证蜂蜜的真实性与质量。
目前，在官方检测中，蜂蜜的植物来源是通过蜜花粉学和感官分析来确定的。UNI 11299:2008标准指南指出，蜜花粉学通过识别和量化蜂蜜沉积物中的花粉及其他微观元素来确定产品的植物和地理来源。经过浓缩处理后，这些微观元素在显微镜下观察，并进行鉴定和计数，从而生成花粉谱图，需要蜜花粉学专家进行专业解读以获取有关蜂蜜来源的信息。需要注意的是，由于蜜蜂不会只采集一种植物的花蜜，单花蜂蜜在花粉成分上存在固有的变异性。此外，蜜花粉学分析耗时较长，且需要高度专业的人员来正确鉴定花粉种类。
感官分析常用于解释蜜花粉学分析结果。蜂蜜的质量评估通过外观、香气、风味和触感等感官特征进行。[34] 传统的蜂蜜感官评估方法在全世界范围内被广泛使用，对质量控制和质量提升具有重要意义，但该方法需要专业培训，且可能存在主观判断。
为克服蜜花粉学和感官分析的主观性问题，人们提出了多种分析方法来鉴定单花蜂蜜。[62] 另一种常规方法是基于测量多种理化参数来验证蜂蜜的植物来源。[41] 当所有测得的理化参数符合相应技术规格时，单花蜂蜜样本被归类为特定类型。[41] 近年来，多种光谱和色谱技术也被用于蜂蜜的鉴定。[12–55] 在食品真实性鉴定中，顶空气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）是一种极具前景和创新性的分析技术。[8] HS-GC-IMS的工作原理类似于质谱法，但挥发性化合物的分离基于离子迁移率而非质荷比（m/z）。HS-GC-IMS的工作原理包括两次分离：首先通过气相色谱柱分离样品化合物，然后在IMS的离子化管内进行化学离子化。分析物离子在电场加速作用下向法拉第板探测器移动，在漂移管（连接光栅和法拉第板的管道）中，离子由于电场加速与漂移气体（氮气）碰撞产生的减速作用而以恒定速度运动。离子通过漂移管所需的时间称为漂移时间，这一时间特征取决于离子的质量和几何结构。[14] 产生的离子电流随时间被电磁计测量。
HS-GC-IMS已被用于识别食品欺诈行为：区分不同品种的蜂蜜（如冬季蜂蜜与普通蜂蜜）[57]、验证橄榄油的真实性[10–22, 54, 56]、判断用于新鲜意大利面的鸡蛋的新鲜度[9]、评估黑胡椒的真实性[59]以及鉴定罂粟壳和胡椒的质量[44]。姚等人使用GC-IMS分析了弋江子单花蜂蜜的香气特征[58]。HS-GC-IMS还可用于验证食品的地理来源。[11–48]
此外，Alia?o-González等人使用GC-IMS检测并量化了蜂蜜中添加的糖浆。[1, 2] 冯等人利用GC-IMS分析了蜂蜜粉[16]。Schanzmann等人区分了北欧生产的椴树、金合欢、油菜籽和银杉蜂蜜[49]。值得注意的是，尽管目前结合保留时间和IMS漂移时间的数据库尚未完善，但质谱与IMS数据的创新结合有望实现更高效的鉴定过程。[6]
本研究旨在确定HS-GC-IMS结合机器学习是否能够有效鉴定意大利单花蜂蜜的植物来源。为此，我们在2022年和2023年收集了来自意大利七个不同植物来源的单花蜂蜜样本，并使用HS-GC-IMS进行了分析。处理后的数据用于构建和验证偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分类器，并计算了性能指标。使用HS-SPME-GC-IMS原型技术鉴定了每种花卉来源的特征性挥发性化合物。如前所述，已有研究利用HS-GC-IMS分析了多种食品中的挥发性有机化合物。[23] 例如，2024年的一项研究使用GC-IMS结合GC–MS区分牦牛奶和牦牛肉中的挥发性化合物。[60] 然而，目前的集成方式仍局限于独立的GC-IMS和GC–MS分析（或正交、顺序工作流程），尚未实现同时捕获保留时间（GC）、迁移率（IMS）和质谱数据的功能。在本研究中，我们使用了结合了HS-SPME-GC-IMS的集成平台，首次实现了在单一工作流程中同时分离、检测和解析蜂蜜中的挥发性有机化合物。
样本
意大利国家养蜂协会（Osservatorio Nazionale Miele）收集了2022年和2023年在意大利收获的136种单花蜂蜜（n=131份），或者由佩鲁贾ICQRF实验室从其官方检测材料中提供（n=5份）。分析对象包括来自七种不同花卉来源的蜂蜜：金合欢（n=27份）、栗子（n=22份）、柑橘（n=...）
HS-GC-IMS光谱热图的评估
通过对蜂蜜进行HS-GC-IMS分析，获得了HS-GC-IMS光谱（强度与GC保留时间、IMS漂移时间的关联图，即热图）。每种检测到的挥发性化合物都作为信号显示，其浓度与红色程度成正比。图2A-G展示了每种单花蜂蜜的代表性HS-GC-IMS光谱。对于椴树、柑橘和蒲公英类别，获得了非常清晰的三维色谱图；而对于栗子类别...
讨论
HS-GC-IMS在鉴定七种单花蜂蜜方面的有效性得到了充分证明。与我们的团队之前测试的方法（包括环境质谱技术和差分IMS [35, 36]）相比，HS-GC-IMS具有显著优势，尤其是在通过保留时间和漂移时间实现二维分离方面提高了选择性。该方法无需任何富集步骤和/或样品稀释...
结论
总之，我们的研究表明，HS-GC-IMS结合多元统计方法是一种有效且经济的方法，可以快速根据植物来源对单花蜂蜜进行分类。初步筛选验证了每批蜂蜜标注的植物来源的真实性。最后，使用具有双重检测功能的原型技术鉴定了每种单花蜂蜜中的特征性挥发性化合物。
CRediT作者贡献声明
菲利波·帕尼（Filippo Panni）：撰写初稿、研究设计、方法学制定、验证、数据可视化、审稿与编辑。安德烈亚·马萨罗（Andrea Massaro）：审稿与编辑、撰写初稿、正式数据分析。卢卡斯·博登本德（Lukas Bodenbender）：审稿与编辑、撰写初稿、数据可视化、方法学研究、数据管理。卡梅拉·扎科梅蒂（Carmela Zacometti）：撰写初稿、研究设计、数据管理。罗伯托·皮罗（Roberto Piro）：项目监督、资金筹集、概念构思、撰写...
资金支持
本研究得到了意大利农业、粮食主权和林业部（MASAF）的支持，具体资金来自“2025年和2026年国家养蜂计划子项目的拨款分配”。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢Osservatorio Nazionale Miele的Lucia Piana、Giancarlo Naldi和Alberto Contessi提供的宝贵帮助。
