《Microchemical Journal》：Integrated plasma-milk metabolomics combined with correlation-based network analysis to discriminate β-casein genotypes in dairy cows
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本研究采用非靶向代谢组学方法分析A1A1、A1A2和A2A2型奶牛血浆及牛奶代谢物差异，发现血浆差异代谢物数量多于牛奶。通过分析，PS(18:0/22:6)和Orotic Acid为关键区分代谢物，并筛选出Thromboxane A2等血浆标志物，为牛奶品质研究提供数据支持。
王传川|陈亚飞|冯晓芳|马云|刘卫平|田佳|赵金燕|薛琳|王华|纪晓云|田晓华|张娟|顾亚玲
宁夏大学动物科学技术学院，中国银川750021
摘要
β-酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质。不同类型的牛奶可能导致消费者出现乳糖不耐受或缓解这一症状。然而，目前尚未完全阐明不同类型牛奶中的关键代谢物。本研究利用非靶向代谢组学（LC-MS）技术分析了具有不同β-酪蛋白基因型的奶牛的血浆和牛奶代谢物。研究发现，血浆代谢组中的差异代谢物数量多于牛奶中的差异代谢物数量。在A1A1VSA1A2、A1A1VSA2A2和A1A2VSA2A2基因型之间的比较中，分别鉴定出68、143和90种血浆差异代谢物；而在牛奶中的差异代谢物数量分别为29、35和48种。进一步通过相关网络分析和随机森林预测，发现PS(18:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))可以作为区分A1A1牛奶和A2A2牛奶的标志物代谢物，并可能通过多种代谢途径与其他蛋白质相互作用。此外，胆碱酸是区分A1A2牛奶和A2A2牛奶的关键标志物化合物。我们对与牛奶关键代谢物具有强相关性且AUC面积大于0.8的血浆代谢物进行了进一步筛选，最终确定了血栓素A2、赖氨酸磷酸酯和脯氨酰苯丙氨酸作为标志物代谢物。本研究获得的标志物代谢物可以为后续关于三种牛奶基因型的研究提供数据支持，也为乳制品质量产业的发展奠定基础。
引言
牛奶因其高营养价值而受到广大消费者的青睐，随着消费者对营养的关注度不断提高，对更健康食品的需求也在增长。许多人饮用牛奶或乳制品后会出现严重的胃肠道不适，被认为是乳糖不耐受。因此，市场上出现了高端A2牛奶。众所周知，传统牛奶和乳制品通常含有A1和A2 β-酪蛋白的混合物，而仅含A1 β-酪蛋白的牛奶在全球市场上所占比例非常小。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，约占总蛋白质含量的80%。在酪蛋白家族中，β-酪蛋白占约25%至35%。进一步细分的话，A1 β-酪蛋白和A2 β-酪蛋白是主要成分。它们的关键区别在于肽链第67位的氨基酸：A1 β-酪蛋白含有组氨酸，而A2 β-酪蛋白含有脯氨酸[1]。
研究表明，牛奶蛋白分解产生的肽具有多种生理功能。β-酪蛋白在肠道内被消化后释放出β-酪蛋白肽（BCM），这是最具生物活性的肽类之一，可以结合μ-阿片受体（μOR），影响胃肠道消化、代谢物的吸收和炎症状态[2]。它还可能通过脑-肠途径影响心血管和中枢神经系统[3]。肠-脑轴主要通过肠道系统产生的代谢物（包括芳香族氨基酸和短链脂肪酸）来发挥作用，这些代谢物作为神经递质合成的构建块，进而影响神经功能和认知发展[4]。研究表明，饮用A2牛奶可减少乳糖消化不良的症状，且A1牛奶在胃中的转运速度比A2牛奶快，表明其在胃或小肠中的消化较少，而在结肠中的发酵较多[5],[6]。Lv等人进行的代谢组学分析显示，A2牛奶中的蛋氨酸、脯氨酸、乙酰乙酸和α-乳糖含量显著高于A1或A1A2牛奶[7]；相反，A1A1牛奶中的胆碱、甘氨酸、柠檬酸和环腺苷单磷酸（cAMP）含量较高。与这些化合物相关的关键代谢途径包括泛酸和辅酶A的合成、丁酸的代谢以及缬氨酸和异亮氨酸的生物合成。我们之前的研究探讨了具有不同β-酪蛋白基因型的奶牛中微生物组成和代谢产物的差异，发现抗炎物质如PGD2-4d和花生四烯酸在A2A2奶牛中更为丰富[8]。鉴定出的微生物主要是黄单胞菌和醋酸菌。
非靶向代谢组学是一种常用的方法，用于分析样品的化学组成并量化代谢物。随着统计方法的发展，非靶向代谢组学越来越多地被用来客观评估与食品质量相关的关键代谢物[9]。此外，代谢组学在检测低分子量物质（如氨基酸、核酸、维生素和有机酸）方面具有优势，因为传统方法容易受到多种因素的影响且灵敏度较低[10]。近年来，代谢组学在研究动物独特代谢特征方面的应用显著增加[11]。然而，在反刍动物中应用该技术具有挑战性，因为宿主-微生物相互作用通过许多复杂的代谢途径进行调节[12]。微生物在一定程度上影响宿主的代谢和炎症，从而影响牛奶产量的变化[13],[14]。因此，明确了解β-酪蛋白变体牛奶产生的代谢物是研究其功能和调控作用的基础。
代谢组学已成为研究生物系统中代谢物组成的关键技术。尽管之前的代谢组学研究为表征不同的代谢特征奠定了基础，但研究重点主要集中在描述性分析上[15]。然而，关于三种β-酪蛋白变体（A1A1、A1A2和A2A2）产生的血浆-牛奶中代谢物的组成和差异的研究相对较少。因此，本研究采用非靶向代谢组学技术分析了A1A1、A1A2和A2A2基因型奶牛的血浆-牛奶代谢物，确定了这三种基因型奶牛血浆-牛奶中代谢物的组成、丰度差异和功能成分。本研究的结果旨在揭示不同β-酪蛋白变体之间牛奶成分的差异，同时进一步支持关于A1和A2类型牛奶营养特性的现有证据。
伦理声明
本动物研究获得了宁夏大学动物福利委员会的批准（伦理编号：NXU-A-2025-0281），并遵循了中国农业部动物使用指南（北京）的规定进行。
血浆和牛奶样本的收集
本实验中的奶牛来自宁夏农垦贺兰山乳业公司。选择标准如下：30头健康、体况相似、首次分娩且在同一环境中饲养的荷斯坦奶牛
三种基因型奶牛血浆代谢物的特征
鉴定出的血浆代谢物进行了分类和统计分析。结果显示，在类别层面，脂肪酰基（Fatty Acyls）的比例最高（15.19%）；其次为羧酸及其衍生物（Carboxylic Acids and Derivatives，12.24%）（图1A）。在超类别层面，脂质及类脂质分子（Lipids And Lipid-Like Molecules）的比例最高（32.35%），其次是有机酸及其衍生物（Organic Acids and Derivatives，17.12%）（图1B）。PCA和OPLS-DA的结果表明样本之间存在显著差异
讨论
牛奶中的主要蛋白质是酪蛋白，它在肠道中被消化后会释放出多种生物活性肽，其中BCM-7主要来自A1β-酪蛋白[16]。过去的研究表明，摄入A1β-酪蛋白或BCM-7会导致动物和人类的肠道炎症增加[17]。此外，临床试验发现，含有A2β-酪蛋白的牛奶比含有A1β-酪蛋白的牛奶更能有效改善胃肠道症状[18]。
结论
本研究利用非靶向代谢组学技术分析了具有三种β-酪蛋白基因型的奶牛的血浆-牛奶。通过相关网络分析和随机森林预测，发现PS(18:0/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)可能是区分A1A1牛奶和A2A2牛奶的标志物代谢物，而胆碱酸是区分A1A2牛奶和A2A2牛奶的关键标志物代谢物。通过代谢组学综合分析得到的关键代谢物包括：血栓素A2、赖氨酸磷酸酯
作者贡献声明
王传川：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件使用、资源获取、正式数据分析、数据整理、概念构思。陈亚飞：监督、软件使用、资源管理、项目实施、方法设计、资金筹集。冯晓芳：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件使用、方法设计。马云：初稿撰写、数据可视化、验证、方法设计、实验设计、资金筹集。
资助
“宁夏地区奶牛分子育种的液体芯片研发及基因组数据分析平台建设”（2023BCF01004）项目。自治区青年拔尖人才培养项目。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
