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自然深共熔溶剂（NADES）合成及其在涡旋辅助分散液-液微萃取（VADLLME）中的应用研究表明，通过乳酸和d-山梨醇等天然成分配比合成的六种NADES系统，经ATR-FTIR证实形成氢键网络，其中（LA）?-Sor因负0.5430 eV强相互作用和6.7680 eV大HOMO-LUMO间隙最稳定。该方法以500 μL NADES和200 μL氯仿为萃取体系，对水体和膳食补充剂中睾酮和去甲睾酮的检测限达0.02 μg/L，线性R2>0.9990，回收率85%-112%，环境兼容性AGREE评分0.60，实践可行性BAGI评分70，证实了绿色微萃取技术的可行性。
阿兹琳·阿西金·姆哈德·卡马尔（Azreen Asyikin Mhd Kamal）、艾哈迈德·侯赛尼·穆罕默德（Ahmad Husaini Mohamed）、努尔法蒂玛·亚哈亚（Noorfatimah Yahaya）、萨兹琳达·卡马鲁扎曼（Sazlinda Kamaruzaman）、希拉·钱德琳（Sheela Chandreen）和万·纳齐哈·万·易卜拉欣（Wan Nazihah Wan Ibrahim）
马来西亚雪兰莪州沙阿阿兰市玛拉技术大学应用科学学院，邮编40450
摘要
本研究使用乳酸、脯氨酸、葡萄糖、蔗糖和D-山梨醇以不同的摩尔比合成了六种天然深共晶溶剂。随后通过ATR-FTIR分析确认了这些溶剂的成功合成，分析结果显示O-H键伸缩带（3200–3600 cm?1）发生了位移。采用密度泛函理论（DFT，B3LYP/6-31G(d,p)和B3LYP/6-31G(d,p)）计算方法来阐明氢键相互作用、稳定性和电子性质。所有合成的天然深共晶溶剂（NADES）均表现出氢键作用，其中(LA)?–Sor化合物最为稳定：它具有四个氢键，负的相互作用能（-0.5430 eV），以及较大的最高占据分子轨道与最低未占据分子轨道能级差（6.7680 eV）。随后开发了一种基于VADLLME（涡流辅助分散液-液微萃取）的方法，使用(LA)?–Sor作为环保分散剂，结合500 μL溶剂和200 μL氯仿，成功从自来水和食品补充剂中高效提取了诺龙和睾酮。该方法表现出优异的线性（R2 = 0.9990–0.9996）、良好的精确度、低检测限和满意的回收率，并获得了0.60的AGREE评分（表示良好的环境兼容性）和70的BAGI实用性评分。
引言
随着人们对身体健康的重视，非治疗性使用合成类固醇（如睾酮及相关雄激素）的情况也在增加。尽管这些物质最初是为治疗激素缺乏和肌肉萎缩疾病而设计的，但由于身体形象压力以及在线购买的便利性，运动员和娱乐性使用者中仍存在滥用现象，有报告指出业余运动员中的使用率高达57%[1]。这些化合物的消耗量不断增加引发了环境问题，因为大量未被改变或以活性代谢物的形式通过废水途径排入水体[2]。即使在微量浓度下，合成类固醇也会干扰水生生物的内分泌系统，导致不良的生理和行为反应[3]。鉴于传统废水处理方法的去除效率有限，系统监测环境水体中的类固醇残留物对于有效评估风险和保护水质至关重要[4]。在类固醇分析中，常采用液-液微萃取（LLME）、液相微萃取（LPME）和固相萃取（SPE）技术，而DLLME因其操作简便、效率高（得益于溶剂-水相之间的增强相互作用）而成为优选方法。然而，传统DLLME依赖于有毒且不可持续的有机溶剂，这引发了重大的环境和健康问题[4]。近年来，疏水性离子液体（ILs），如1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C?MIm][PF?])，作为从复杂基质中提取药物残留物（包括类固醇）的替代品显示出巨大潜力。它们的可调物理化学性质使其与LC-MS/MS等先进分析平台高度兼容[5]。尽管如此，ILs在常规分析中的应用仍受限于高昂的合成成本和复杂的制备过程（通常涉及多步反应和纯化步骤[6]）。因此，人们开始寻找更环保、更可持续的萃取介质。天然深共晶溶剂（NADES）因其可生物降解性、不易燃性和可调的物理化学性质而受到关注，成为潜在的替代品[7]。这类溶剂的极低熔点归因于其分子结构中的分子内氢键作用，这得益于混合物中存在的氨基、羧基、羰基和羟基[8]。NADES由两种天然成分按特定摩尔比混合而成：一种氢键供体和一种氢键受体。这种混合降低了溶剂的粘度，促进了离子键和氢键等分子间相互作用的形成[8]。NADES通常由季铵盐和生物系统中的天然初级代谢物组成，如糖类、有机酸、胺类、氨基酸、二醇和酰胺[9]。理解NADES中的分子级相互作用具有挑战性，但理论方法（尤其是计算化学）在阐明这类系统的结构和动态方面发挥着关键作用[10]。密度泛函理论（DFT）为化学相互作用、原子和分子系统的稳定性和反应性提供了宝贵的见解[13]。DFT可以预测振动光谱、分析电子密度分布并计算相互作用能，对于识别和分析氢键尤其有用[14]。因此，DFT在深入理解NADES中的分子相互作用（尤其是氢键形成）方面至关重要[15]。
密度泛函理论（DFT）被广泛用于研究各种系统中的氢键和分子间相互作用。例如，Kazachenko等人（2022年）使用DFT（B3LYP/6-311++G(d,p)）研究了磺胺酸-水复合物的几何结构和相互作用能，并利用Atoms-in-Molecules（AIM）方法分析了氢键[16]。Furer等人（2021年）应用DFT将p-六磺酸杯[6]芳烃六钠盐和p-叔丁基杯[6]芳烃的实验振动光谱与理论计算结果进行对比[17]。Zheng等人（2021年）结合DFT（M06-2×/6-311+G(2d,p)和FTIR研究了离子液体-DMSO二元系统中的结构和氢键[18]。Parra等人（2023年）利用DFT研究了肽纳米管在H键驱动下的自组装几何结构和结合能[19]。这些研究共同展示了DFT在阐明不同化学系统中的氢键和分子相互作用方面的多功能性[19]。尽管关于NADES的分子研究仍有限，但一些研究集中在深共晶溶剂（DES）上。例如，Devi等人（2023年）使用DFT（B3LYP/6-311+G(d,p)理论研究了薄荷醇（HBA）和肉豆蔻酸（HBD）的混合物，分析了分子静电势（MEPs）、前沿分子轨道（FMOs）和振动特性，并通过Gaussian 09W和VEDA计算结果对比实验FTIR光谱以阐明相互作用机制[20]。Hamami和Issaoui（2022年）发现氢键增强了DES分子的稳定性，他们使用DFT（B3LYP/6-311++G(d,p)研究了丙酮酸-水复合物，通过Atoms-in-Molecules（AIM）优化了含1至4个水分子的结构并分析了电子密度[21]。Zhang等人（2014年）结合FTIR光谱和DFT计算研究了氯化胆碱-六水合氯化镁DES，通过实验和理论对比阐明了分子结构和电化学机制[22]。
本研究旨在开发并评估天然深共晶溶剂（NADES）作为涡流辅助分散液-液微萃取（VADLLME）中的绿色分散剂，用于高效检测水和食品补充剂样品中的类固醇。制备了六种摩尔比为1:1的NADES体系，并对其物理化学性质和氢键相互作用进行了表征。随后通过DFT计算进一步阐明了这些NADES的氢键行为、稳定性和电子性质。其中最优的NADES通过结构优化、前沿分子轨道（FMO）分析和分子静电势（MEP）映射进行了进一步研究。随后，使用DFT研究中确定的NADES作为分散剂优化了VADLLME流程，有效提取了目标分析物，并评估了该方法的有效性，包括线性、精确度、准确性和检测限。最后，通过Analytical GREEnness（AGREE）指标评估了该方法的环境可持续性，通过Blue Applicability Grade Index（BAGI）工具评估了其实用性。这种综合策略结合了可持续溶剂的合理计算设计和微型萃取技术，为复杂基质中的类固醇痕量检测提供了一种经过验证的、环保的方法，体现了方法创新性、灵敏度和实际应用性。
化学品和试剂
睾酮（C??H??O?，≥98%）、诺龙（C??H??O?，≥98%）、乳酸（C?H?O?，85%），均为ACS级试剂；脯氨酸（C?H?NO?，99.5%）；葡萄糖（C?H??O?，99.5%）；蔗糖（C??H??O??，99.5%）；D-山梨醇（C?H??O?，98%）；有机溶剂包括氯仿（CHCl?，98%）、乙醇（C?H?，99.9%）、乙腈（C?H?N，99.9%）、HPLC级丙酮腈（C?H?N，99.9%）、1-十二醇（C??H??O，98%）、乙酸乙酯（C?H?O?，98%）和二氯甲烷（CH?Cl?，≥99.8%），均购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。NADES的制备和ATR-FTIR分析
具体细节略
分子功能的光谱确认
傅里叶变换红外（FTIR）光谱是一种广泛用于通过识别与分子键和原子振动相关的官能团来表征样品的技术[32]。因此，进行了FTIR分析（见图S1），以识别合成的NADES中的官能团并确认氢键的形成。所有制备的NADES的相应波数见表S1。结果显示，所有NADES在特定波长范围内均显示出宽吸收带结论
由乳酸（LA）和D-山梨醇（Sor）组成的NADES成功合成，并被评估为涡流辅助分散液-液微萃取（VADLLME）方法中的分散剂。ATR-FTIR分析通过3352.2 cm?1、1721.5 cm?1和1221.3 cm?1处的特征位移和强度变化确认了氢键的形成，表明了强烈的分子间相互作用和NADES的成功合成。密度泛函理论（DFT）计算进一步作者贡献声明
阿兹琳·阿西金·姆哈德·卡马尔（Azreen Asyikin Mhd Kamal）：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据整理。艾哈迈德·侯赛尼·穆罕默德（Ahmad Husaini Mohamed）：撰写、审稿与编辑、概念构思。努尔法蒂玛·亚哈亚（Noorfatimah Yahaya）：监督、软件使用、方法学设计、概念构思。萨兹琳达·卡马鲁扎曼（Sazlinda Kamaruzaman）：撰写、审稿与编辑、方法学设计。希拉·钱德琳（Sheela Chandreen）：撰写、审稿与编辑。万·纳齐哈·万·易卜拉欣（Wan Nazihah Wan Ibrahim）：撰写、审稿与编辑、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
作者衷心感谢
玛拉技术大学（UiTM）通过内部拨款（编号600-RMC/GIP 5/3 (063/2022）提供的财务支持以及提供的设施。
