《Mitochondrion》：Patient-derived TWNK variants recapitulate multisystem Perrault syndrome pathology in a mouse model
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本文针对罕见遗传病Perrault综合征缺乏理想动物模型的难题，研究人员通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，首次构建了携带患者特异性TWNK基因复合杂合（c.814G>A/c.1166C>T）及纯合突变的小鼠模型。该模型成功模拟了患者的核心病理特征，包括感觉神经性听力损失、运动功能减退、轴突性周围神经病变，并揭示了线粒体DNA（mtDNA）拷贝数及ATP合成减少等关键分子机制。该研究为深入探索Perrault综合征的致病机理及开发靶向治疗策略提供了重要的临床前研究平台。
Perrault综合征（PS）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，患者通常在婴幼儿期即出现双侧感音神经性耳聋，女性患者成年后往往伴随卵巢功能衰竭，部分患者还会出现进行性的神经系统症状，如运动障碍、周围神经病变等。这种疾病与九个基因的突变有关，其中TWNK基因编码的线粒体DNA（mtDNA）解旋酶Twinkle对维持mtDNA的稳定与复制至关重要。尽管其临床与遗传基础逐渐清晰，但该病发病率极低，导致获取患者样本异常困难，严重制约了其致病机制的深入研究和潜在疗法的开发。更为棘手的是，此前已有的Twinkle全身敲除小鼠模型在胚胎期即致死，而组织特异性敲除模型又无法完全模拟患者多系统受累的复杂病理特征。同时，虽然存在用于研究常染色体显性遗传性进行性外眼肌麻痹的Twinkle点突变小鼠模型，但它们并不能重现Perrault综合征特有的听力损失和神经学特征。因此，开发能够精准模拟患者特异性突变的疾病模型，成为了破局的关键。
为了解决上述难题，一项发表于《Mitochondrion》期刊的研究迈出了关键一步。研究人员从一位携带TWNK基因复合杂合突变（c.811G>A/p.Ala271Thr 和 c.1163C>T/p.Ala388Val）的Perrault综合征患者出发，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建了对应小鼠同源位点（c.814G>A/p.Ala272Thr 和 c.1166C>T/p.Ala389Val）的纯合及复合杂合突变小鼠模型。该研究首次建立了能够系统性再现Perrault综合征多系统病理的遗传精确小鼠模型，为深入解析疾病机制和评估靶向治疗策略提供了前所未有的平台。
研究人员在开展这项研究时，运用了几个关键技术方法。他们首先通过CRISPR/Cas9介导的同源重组，将患者来源的TWNK点突变精确引入C57BL/6小鼠基因组，构建了纯合（TwinkleA272T、TwinkleA389V）和复合杂合（TwinkleA272T/A389V）基因型小鼠。随后，他们通过听觉脑干反应（ABR）测试评估了小鼠的听觉功能，利用开放场地实验（OFT）和步态分析来量化其运动行为，并借助透射电子显微镜观察了坐骨神经的髓鞘超微结构。在分子层面，研究团队采用定量聚合酶链式反应（qPCR）检测了肌肉和脑组织中的线粒体DNA（mtDNA）拷贝数，并使用荧光素酶法测定了组织ATP含量，以评估线粒体功能。
4.1. 患者复合杂合TWNK突变的鉴定与致病性评估
研究人员对一位Perrault综合征患者及其家系进行了基因分析，发现该患者携带TWNK基因c.811G>A (p.Ala271Thr) 和 c.1163C>T (p.Ala388Val) 的复合杂合突变，分别遗传自其父母。生物信息学分析显示，这两个突变位点在多个物种中高度保守，且致病性预测软件（PolyPhen-2）评分提示其可能损害蛋白质功能。这为后续构建对应的小鼠突变模型提供了遗传学和分子学依据。
4.2. 重现人类Perrault综合征突变的Twinkle突变小鼠模型的构建与验证
利用CRISPR/Cas9技术，研究团队成功构建了携带p.Ala272Thr、p.Ala389V突变（分别对应人类p.Ala271Thr和p.Ala388V突变）的纯合及复合杂合Twinkle突变小鼠。基因型测序证实了突变的成功引入。体重监测显示，突变小鼠从出生到16周龄的总体生长状况与野生型小鼠相比无显著差异，表明突变并未影响小鼠的整体生长发育。
4.3. Twinkle突变小鼠表现出严重听觉损伤，呈现感音神经性耳聋表型
对4月龄小鼠进行的听觉脑干反应（ABR）测试表明，所有基因型的突变小鼠在点击声和纯音（8-32 kHz）刺激下的听觉阈值均显著高于野生型对照，且ABR波V的振幅显著降低。这证实了Twinkle突变导致了小鼠严重的听力损失，成功模拟了Perrault综合征患者的核心症状之一。
4.4. Perrault综合征小鼠模型中的线粒体功能障碍：mtDNA耗竭与ATP缺乏
分子检测发现，与野生型相比，Twinkle突变小鼠在骨骼肌和脑组织中的mtDNA拷贝数均显著降低。与此同时，这些组织中的ATP含量也明显下降。这揭示了TWNK突变通过破坏mtDNA的稳定与复制，导致细胞能量（ATP）合成障碍，从而为患者的听力损失和神经症状提供了分子病理学解释。
4.5. Twinkle突变小鼠存在运动缺陷和周围神经病变，但步态协调性保留
行为学测试显示，突变小鼠在开放场地中的总运动距离显著减少，表明其存在运动能力减退。透射电镜观察发现，突变小鼠的坐骨神经中大型有髓神经纤维数量明显减少，证实了周围神经轴突病变的存在。然而，步态分析表明突变小鼠的静止步态模式正常，前后肢运动协调，未见拖拽现象。这说明Twinkle突变导致了外周神经病变和整体运动功能下降，但基本的步态协调性尚未受损。
综合来看，该研究成功构建了首例能够系统性重现Perrault综合征多系统病理特征的TWNK点突变小鼠模型。与以往主要用于研究其他线粒体病（如adPEO）的Twinkle模型不同，本研究构建的A272T/A389V复合杂合突变小鼠不仅存活至成年，而且精准模拟了患者的听觉丧失、运动障碍、轴突性周围神经病变等核心临床表型，并揭示了其背后的线粒体功能障碍机制——即mtDNA拷贝数减少和ATP合成不足。这一模型克服了患者样本稀少、异质性大以及传统基因敲除模型胚胎致死或无法模拟全身性病变的局限性。尽管模型未能重现女性患者的卵巢功能障碍（可能源于物种差异或表型不完全外显），但其在神经系统和听觉系统上的成功模拟已极具价值。该模型为在遗传背景均一的条件下，系统性研究Perrault综合征的发病机制、疾病进程以及评估潜在的治疗干预措施（如针对线粒体功能的药物或基因疗法）提供了一个至关重要的临床前平台。这项研究不仅填补了Perrault综合征缺乏理想动物模型的研究空白，也为未来开发针对此类罕见遗传性线粒体疾病的精准治疗策略奠定了坚实的基础。
