《International Journal of Oral Science》：Single-cell transcriptional atlas reveals distinct immune-chondrocyte crosstalk mechanisms in temporomandibular joint osteoarthritis induced by different types of occlusal disorder
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本文首次通过小鼠下颌髁突单细胞转录组学，系统揭示了颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）在健康与疾病状态下的细胞异质性及免疫微环境。研究发现，前牙早接触（APC）模型与单侧前牙反??（UAC）模型通过激活不同的关键信号通路（如中性粒细胞来源的TNF-α信号和Thbs1-Sdc4/BSP信号）驱动疾病进展，并证实靶向干预这些通路具有治疗潜力，为TMJOA的精准治疗提供了新的细胞与分子机制见解。
引言
颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular joint osteoarthritis, TMJOA）是一种进行性退行性疾病，影响下颌髁突软骨和软骨下骨，导致关节疼痛、活动受限和功能障碍。与其它关节的透明软骨不同，下颌髁突在细胞组成和细胞外基质上具有独特性，其发病机制极为复杂，涉及软骨基质降解、软骨细胞代谢、细胞死亡、软骨下骨重塑以及滑膜组织和滑液介导的炎症等多方面。然而，软骨和骨退行性病变的复杂机制远未被阐明。炎症失调软骨细胞代谢并导致基质降解已被广泛认知。外界刺激触发滑膜组织的炎症反应，导致髁突表层组织损伤，引起软骨侵蚀和开裂。越来越多的证据表明，骨软骨连接处是软骨侵蚀发生的另一个重要部位，软骨细胞肥大、异常的内软骨成骨和血管生成共同促进了骨关节炎的进展。这些机制可能涉及复杂的细胞和信号网络，而对这些网络缺乏详细的表征阻碍了对病理机制的理解。本研究旨在填补这一研究空白。
结果
单细胞转录谱分析鉴定小鼠髁突中的四种主要细胞类型
通过构建前牙早接触（anterior premature contact, APC）模型和单侧前牙反??（unilateral anterior crossbite, UAC）模型，成功诱导了小鼠下颌髁突出现显著的TMJOA样病变。组织学显示软骨表面粗糙、被骨化区域侵蚀、软骨层厚度减少以及软骨内细胞排列紊乱。对对照组、APC组和UAC组三个数据集进行无监督聚类分析后，捕获的细胞被划分为14个不同的细胞簇，主要归类为软骨细胞、免疫细胞以及内皮细胞/周细胞。与对照组相比，APC或UAC模型组的髁突中软骨细胞比例下降，而免疫细胞比例增加。
健康与TMJOA髁突中的软骨细胞异质性
软骨细胞是下颌髁突的主要细胞成分，在稳态下占所鉴定细胞总数的91.36%，占非免疫细胞的98.65%。软骨细胞在转录表达和生物学功能上具有高度异质性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合三个数据集，根据不同的基因表达谱和功能，将软骨细胞进一步区分为16个细胞簇，最终归纳为8个功能亚群：
- 1.
成熟软骨细胞：高表达软骨细胞标志物Col9a1、Col11a2、Scrg1。
- 2.
Col10a1high肥大软骨细胞：高表达肥大软骨细胞标志物Col10a1，并富集于“生物矿化”、“骨化”和“成骨细胞分化”等GO条目，也高表达Ibsp。
- 3.
炎症相关软骨细胞：高表达促炎标志物Nos2，以及Cxcl1、Cxcl2、Cx3cl1和TGF-β信号基因Inhba，功能特征与白细胞迁移和激活、细胞因子和趋化因子介导的信号传导相关。
- 4.
Mmp13high软骨细胞：特征为高表达Mmp13，也高表达Ifitm3和Lum。
- 5.
修复性软骨细胞：显著高表达Atf3、Hspa1a和Hspa1b，功能富集于“对未折叠蛋白的反应”、“对拓扑错误蛋白的细胞反应”、“负调控炎症反应”和“负调控白细胞激活”。
- 6.
纤维化软骨细胞：高表达成纤维细胞/纤维化标志物S100a4和Abi3bp，也高表达Thbs4和Mfap4，功能与细胞外基质组织、细胞-基质粘附、再生和伤口愈合密切相关。
- 7.
矿化相关软骨细胞：功能特征高度特化为生物矿化，高表达Ifitm5以及骨钙素编码基因Bglap和Bglap2。
- 8.
软骨细胞祖细胞：高表达干细胞相关标志物Stmn1、Birc5和细胞周期基因Cdk1、Top2a、Cenpa和Mki67，生物学过程与有丝分裂和细胞周期相关。
在稳态下，软骨细胞祖细胞和纤维化软骨细胞位于髁突浅层，NOS2high炎症相关软骨细胞位于浅层下方，Col10a1high肥大软骨细胞位于深层靠近骨软骨连接处，而MMP13high和OCNhigh软骨细胞则位于深层上方。
不同TMJOA模型诱导软骨细胞和免疫细胞群频率、组成和转录表型的差异变化
单细胞转录组学揭示了咬合紊乱诱导的TMJOA髁突中的转录组变化。APC和UAC模型均导致软骨细胞频率降低。与健康髁突相比，APC模型髁突中Mmp13high软骨细胞、Col10a1high肥大软骨细胞比例增加，而炎症相关软骨细胞比例减少；UAC模型髁突中Col10a1high肥大软骨细胞、炎症相关软骨细胞比例减少，而Mmp13high软骨细胞、纤维化软骨细胞和修复性软骨细胞比例增加。软骨细胞祖细胞的比例在两个模型中均有轻微上升。伪时间分析表明，APC和UAC模型中软骨细胞的发育轨迹被打乱，与免疫荧光观察到的细胞排列紊乱、失去簇依赖性表型特征的结果一致。
免疫细胞被聚类为12个群体，进一步注释为9种不同的细胞类型。咬合紊乱模型显著增加了免疫细胞的频率。免疫细胞簇的组成分析表明，在TMJOA中，中性粒细胞（尤其是II期中性粒细胞亚群）扩增，而单核细胞、巨噬细胞和B细胞则显著缩减少。在APC模型的中性粒细胞前10个差异表达基因中，观察到Abcg1显著上调和Ftl1下调，表明脂质稳态和细胞铁代谢失调；而在UAC模型中，中性粒细胞中Hspa1a/b、Il1r2和Thbs1的表达增加，表明修复和组织重塑增强。
转录推断的免疫-软骨细胞相互作用在APC和UAC模型间增强且差异调控
转录推断分析发现了软骨细胞与免疫细胞亚群之间存在相互作用，并且在咬合紊乱模型髁突中这种作用增强，但相互作用的信号通路存在差异。与健康对照组相比，TNF信号通路被推断为APC模型髁突中增强最显著的信息流，而骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）信号则是UAC模型中增加最显著的信号。免疫组化染色证实，APC模型髁突的软骨细胞和免疫细胞中TNF-α高表达，而在UAC模型中则不那么高。
单细胞转录组分析表明，在稳态下，流出的TNF信号主要来源于巨噬细胞，而在APC模型髁突中，该信号大幅增加且主要来源于II期中性粒细胞，与其它免疫细胞和软骨细胞的潜在相互作用增强。免疫荧光显示APC模型中软骨细胞、MPO+中性粒细胞和CD68+巨噬细胞的TNF-α产生显著增加。在UAC模型中大幅增加的流出BSP信号，则主要来源于Col10a1high肥大软骨细胞、矿化相关软骨细胞和成熟软骨细胞。信号分析表明，Thbs1-Sdc4和Col2a1信号在介导I/II期中性粒细胞-软骨细胞相互作用中占主导地位，在UAC模型中从中性粒细胞流向软骨细胞的这些信号输出比健康对照组强得多。Col2a1信号在软骨细胞间的增强多于中性粒细胞-软骨细胞相互作用。免疫荧光显示，UAC模型髁突中从软骨到软骨下骨存在广泛的BSP阳性区域，在骨骼和骨软骨连接区域具有高免疫反应性，这些区域与内皮标志物CD31的表达共定位。
靶向信号通路给药缓解不同咬合障碍诱导的TMJOA软骨侵蚀
与软骨层排列有序、完整性好的健康髁突软骨相比，APC或UAC诱导的病变表现为软骨层厚度显著减少，改良Mankin评分评估的骨关节炎严重程度加剧。给予TNF-α抑制剂依那西普（Etanercept）可显著改善APC模型诱导的软骨损伤，但对UAC模型小鼠的保护作用不明显。CXCR2/CXCR1抑制剂那伐芦新（Navarixin）可减轻UAC模型诱导的骨关节炎，但对APC模型引起的髁突病变无统计学显著影响。
讨论
本研究首次揭示了小鼠TMJ髁突软骨细胞的转录组异质性。通过健康-疾病的比较，在单细胞分辨率下为TMJ髁突的稳态和TMJOA的发病机制提供了见解。研究发现，Mmp13high软骨细胞、Col1a1high软骨细胞和Col10a1high软骨细胞是不同的细胞簇。表达MMP13或骨钙素的软骨细胞主要位于增殖区而非肥大区。具有肥大形态、位于深层的Collagen-Xhigh软骨细胞部分而非全部对MMP13或骨钙素呈阳性。与空间关系暗示的发育顺序一致，伪时间分析表明Mmp13high软骨细胞、Col1a1highBglaphighIfitm5high矿化相关软骨细胞处于成熟软骨细胞之前的阶段，而Col1a1high软骨细胞处于轨迹末端。这些发现表明，在TMJ髁突中，软骨细胞在增殖早期就具有矿化特征。Collagen-X而非MMP13或骨钙素，可作为肥大软骨细胞的标志物。
与其它关节软骨的单细胞图谱一致，本研究在髁突浅层鉴定出STMN1highBIRC5highDHFRhigh软骨细胞祖细胞，这些细胞也可称为“增殖软骨细胞”。在TMJ髁突中，一个S100A4highABI3BPhigh的“纤维化软骨细胞”群体被鉴定出来，位于软骨浅层，沿伪时间轨迹位于软骨细胞祖细胞之后。一个NOS2high软骨细胞群体以促炎表型为特征，被鉴定位于浅层下方，沿伪时间轨迹位于纤维化软骨细胞之后。值得注意的是，稳态下软骨细胞簇有序排列的空间关系和伪时间轨迹，被咬合紊乱诱导的TMJOA显著打乱。病变髁突显示出紊乱的伪时间轨迹和被侵蚀软骨层中杂乱挤压的细胞。这些结果突显了TMJ髁突软骨细胞相对于其它关节独特的转录谱，并提示软骨细胞发育轨迹可能参与了TMJOA的发病机制。
单细胞转录组分析揭示了UAC模型髁突中潜在的BSP信号增强。既往研究支持BSP作为骨形成、骨折愈合和骨关节炎病理中血管生成的关键介质，这与本研究发现BSP免疫反应区域与血管生成标志物CD31共定位的结果一致。骨软骨连接处的新生血管形成是TMJOA的一个重要致病特征。新血管侵入软骨，促进软骨细胞肥大和基质矿化。软骨内血管生成， coupled with neoneurogenesis，会加剧疼痛并促进软骨骨化。本研究的组织学检查和scRNA-seq分析提示血管生成是UAC诱导的TMJOA的主要致病因素之一。考虑到Thbs1-Sdc4信号的促血管生成作用，血管侵入后免疫细胞浸润增加可能通过促进正反馈环路加剧软骨侵蚀。增强的Thbs1-Sdc4信号被发现是UAC扰乱的软骨细胞-免疫细胞相互作用中的主导变化，突显了血管生成在UAC诱导的发病机制中的关键作用。因此，通过给予CXCR2/CXCR1抑制剂那伐芦新靶向中性粒细胞浸润，试图阻断这一致病过程，结果髁突软骨损伤被显著减轻，但远未完全恢复正常。治疗效果的限制可能源于多种机制。
TMJOA难以治疗的原因之一是其发病机制涉及遗传、机械和生化等多种因素。不同的病因可能对应着不同的致病机制。目前通过制造咬合紊乱、关节内注射炎症介质、基因修饰或手术操作（如关节盘部分穿孔）来建立TMJOA动物模型。尽管成功诱导了OA样病变，但这些模型在模拟OA可能由单一或多种病因学因素组合导致的复杂临床情况方面仍显不足。UAC和咬合抬高模型基于关节负荷过载或不平衡导致机械刺激从而诱发和加重TMJOA的认知，被用于模拟TMJOA。本研究中，两个模型间转录组推断的免疫-软骨细胞互作机制的差异表明，TMJOA的发病机制可能高度依赖于具体情境，而不是由特定模型揭示的机制所能代表。即使是咬合负荷诱导的TMJOA，也因咬合紊乱类型不同而涉及不同的发病机制，因此针对发病机制的治疗应相应调整。然而，由于转录组数据固有的局限性，本研究的功能意义需谨慎解读。scRNA-seq数据推断的是由配体-受体共表达模式介导的潜在细胞间通讯，而非提供验证功能性结合事件所必需的蛋白质-蛋白质相互作用的直接证据。需要进一步研究优先进行功能验证，以将观察性发现转化为可操作的治疗策略。
既往对人类TMJOA髁突的研究鉴定出类似的免疫细胞类型和具有不同功能富集的软骨细胞簇。然而，由于缺乏健康对照以及人类样本TMJOA病因学信息缺失，关于致病机制的比较有限。本研究结果不能直接外推至人类疾病，因为小鼠和人类的TMJ在解剖和病理上存在差异。然而，本研究证明了TMJOA发病机制的高度复杂性，且可能因不同病因学因素而异。TMJOA的致病机制和靶向治疗或许更适合基于特定的病因学条件来阐述，而非普遍适用。在人体组织中进行疾病-健康比较的进一步研究将具有重要意义。
材料与方法
动物实验经四川大学华西口腔医学院伦理委员会批准。使用90只4周龄雌性C57BL/6小鼠，平均分为三组：健康对照组、APC模型组和UAC模型组。APC模型通过在上切牙腭侧粘接树脂斜面构建，UAC模型通过在左上颌和下颌切牙上粘接一对不锈钢管构建，迫使小鼠下颌左移。实验终点为4周。为检验靶向信号通路给药对APC或UAC诱导的小鼠TMJOA的治疗效果，另使用42只小鼠，平均分为七组。依那西普通过腹腔注射给药，那伐芦新同样经腹腔注射给药。实验终点收取下颌骨进行组织学检查。
从髁突解剖出关节软骨组织，用胶原酶Ⅱ和胰蛋白酶解离，制备单细胞悬液。使用SeekOne? MM单细胞3’文库制备试剂盒构建scRNA-seq文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行PE150测序。使用Seurat软件包进行数据质量控制、整合、降维和聚类分析。对细胞簇进行注释，并进行基因本体富集分析、伪时间轨迹分析和细胞-细胞通讯分析。对下颌骨样本进行石蜡包埋切片，进行H&E染色、Masson染色、番红O-固绿染色以及多重免疫荧光染色。使用Image J测量软骨厚度并评估改良Mankin评分。scRNA-seq数据的统计分析使用R软件，免疫化学半定量数据使用GraphPad Prism软件分析，组间差异采用单因素方差分析及Sidak多重比较检验，P值小于0.05认为具有统计学显著性。
