比较评估与验证猪肺炎支原体的快速定量方法：一种基于PMA的活菌qPCR检测技术的建立

《Scientific Reports》：Comparative evaluation and validation of rapid quantification methods for Mycoplasma hyopneumoniae: development of a PMA-based viability qPCR assay

本文针对猪肺炎支原体体外生长缓慢、传统定量方法耗时长达四周的难题，研究人员比较了CCU、CFU、流式细胞术和ATP发光法等多种方法，并成功建立并优化了基于PMA的活菌定量PCR (v-qPCR)检测技术。该研究首次为支原体属提供了经过验证的v-qPCR方法，可将检测时间缩短至数小时，为猪肺炎支原体净化计划提供了潜在的有力工具。

在养猪业中，一种被称为猪地方流行性肺炎的疾病持续造成重大的经济损失，其背后的“元凶”是一种名为猪肺炎支原体 (Mycoplasma hyopneumoniae, M. hyopneumoniae) 的微小病原体。这种病原体有个令人头疼的特性：它在实验室里生长得极其缓慢，就像一个行动迟缓的“慢性子”。为了研究它、控制它，科学家们需要知道它在培养液里到底有多少“活着的”个体，这就涉及到“定量”技术。然而，传统的“金标准”方法，比如颜色变化单位 (CCU) 和菌落形成单位 (CFU)，需要培养长达四周的时间才能得到结果，这无疑大大拖慢了研究和诊断的步伐。有没有更快、更准的方法来清点这些“活着的”细菌呢？这正是本研究试图破解的核心难题。

尽管文献中记载了包括流式细胞术、ATP发光法以及使用叠氮溴化乙锭 (EMA) 或单叠氮化丙啶 (PMA) 的活菌定量聚合酶链式反应 (viability quantitative polymerase chain reaction, v-qPCR) 等多种潜在的快速方法，但这些方法之间的一致性如何？哪种方法最适合用于猪肺炎支原体？此前并没有系统的比较和验证。因此，研究人员开展了一项系统的研究，旨在评估和比较不同的猪肺炎支原体定量方法，验证一种准确的实时定量途径，并为这种具有挑战性的病原体量身定制一种v-qPCR检测方法。这项研究的意义在于，有望将检测时间从“月”缩短到“小时”，为更高效的疾病监测和净化提供关键技术。相关成果发表在《Scientific Reports》上。

为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：使用了三株猪肺炎支原体 (232, J, 和 2010) 进行体外生长动力学评估；系统比较了颜色变化单位 (CCU)、菌落形成单位 (CFU)、流式细胞术和ATP发光法四种定量方法；建立了一套激光共聚焦扫描显微镜 (confocal laser scanning microscopy, CLSM) 方案，用于直接定量培养基中的细菌，并以此验证流式细胞术的准确性；开发并优化了一种基于单叠氮化丙啶 (PMA) 的活菌定量PCR (v-qPCR) 检测方法。

研究结果

不同定量方法对猪肺炎支原体生长动力学的比较评估

本研究首先对三株猪肺炎支原体 (232, J, 和 2010) 的体外生长动力学进行了评估，使用了CCU、CFU、流式细胞术和ATP发光法四种方法。结果显示，尽管不同方法测得的绝对数量存在差异，但所有方法都描绘出了相似的生长动态曲线，并且各检测方法之间表现出高度相关性。这表明，流式细胞术和ATP发光法等快速方法能够可靠地反映猪肺炎支原体的生长情况，可以作为传统耗时方法的有效替代。

通过CLSM和流式细胞术对猪肺炎支原体进行绝对定量

为了更准确地验证流式细胞术的计数结果，研究人员建立了一套CLSM方案，能够直接在培养基中对细菌进行成像和计数。在可控条件下，使用CLSM的计数结果来验证流式细胞术的准确性。分析表明，对于菌株232，两种方法的结果呈现极强的相关性 (r = 0.9973)；对于菌株J，相关性为中等 (r = 0.8933)。这一部分工作为流式细胞术定量猪肺炎支原体活菌提供了重要的显微镜学验证。

开发用于猪肺炎支原体活菌检测的v-qPCR方法

研究的核心成果是开发了一种基于PMA的v-qPCR检测方法。PMA是一种染料，只能穿透死菌的细胞膜并与DNA结合，在光照下使DNA失活，从而在后续的qPCR (quantitative polymerase chain reaction) 中只扩增活菌的DNA。研究人员对该方法进行了优化。结果显示，v-qPCR检测到的活菌数量与流式细胞术检测到的活细胞数量呈强相关 (菌株232的R²值为0.9726；菌株J为0.8628；菌株2010为0.9933，p < 0.05)。对于参考菌株232，该v-qPCR方法的检测限为5 × 10⁴个活菌细胞/毫升。这标志着首次为支原体属建立了一种经过验证的PMA-v-qPCR检测方法。

结论与意义

本研究通过系统的比较和验证，得出以下核心结论：首先，流式细胞术、ATP发光法等快速定量方法与传统的CCU、CFU方法在反映猪肺炎支原体生长动力学上具有良好的一致性，可以替代耗时漫长的传统方法。其次，建立的CLSM方案为流式细胞术的准确性提供了直接证据。最重要的是，本研究成功开发并优化了一种针对猪肺炎支原体的、基于PMA的v-qPCR检测方法。该方法与流式细胞术结果高度相关，并具有高灵敏度。

这项研究的意义重大。它首次为支原体这一大类的病原体提供了经过验证的PMA-v-qPCR检测方案。所建立的流式细胞术和CLSM方案也能用于快速、准确地区分猪肺炎支原体的活菌与死菌。这些方法将定量检测所需的时间从CCU或CFU所需的四周 dramatically 缩短到了仅仅几个小时。这不仅极大提升了实验室研究的效率，更重要的是，一旦在临床样本中得到进一步验证，这种v-qPCR方法有望成为猪肺炎支原体净化计划中一个极具价值的工具，为实现快速诊断、监测和评估净化效果提供关键技术支撑，最终助力于减少养猪业因该病原导致的经济损失。